金鱼望天眼性状受环境和遗传影响的初步研究

李荣妮，孙砚胜，田 仲，王赛赛，张 欣

(1.北京市水产科学研究所暨国家淡水渔业工程技术研究中心，北京 100068；2.农业农村部都市农业(北方)重点实验室，北京 100097；3.渔业生物技术北京市重点实验室，北京 100097)

金鱼被誉为我国的“国鱼”，不仅是世界上最早被人工饲养的观赏鱼类，也是研究种内演化的绝佳实验材料。望天眼金鱼，也称‘朝天眼、望天龙、朝天龙、顶天眼’，眼睛一直望天，眼圈周围有色泽，眼球似龙睛部分突出眼眶之外，在水中游动时，瞳孔明亮，比龙睛更威武，是金鱼中名贵品种。中国金鱼图鉴中介绍：朝天龙，北人称“望天龙”、眼球向上生长、瞳孔周围环绕着金色眼圈，其鱼之妙在于眼睛朝天；你无论从哪个角度看它似乎都在审视着你，这在中国古代有仰望天子之寓意，系清宫中最受宠爱的品种。目前报道的鱼眼睛随生长发育会发生变化而翻转的最典型的为比目鱼,其在变态发育过程中，随着从浮游到底栖，一只眼睛从头部一侧移到另一侧。而金鱼不属于变态发育动物，望天眼金鱼品系是在生长发育过程中，眼睛逐渐完成向上翻转，从外观和生长发育来看，其眼睛翻转和比目鱼眼睛移动是完全不同的。而关于金鱼望天眼突变体的具体产生和选育过程，目前尚无确切的文献报道。

本研究针对金鱼望天眼性状是否受环境(水深和容器透光性)影响和其性状是否能稳定遗传，而开展初步实验，以期为提高望天眼金鱼正品率和培育新品种提供基础生产数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验鱼

金鱼亲本取自北京市水产科学研究所小汤山水产良种繁育基地，为2冬龄蛋种红望天眼金鱼和1冬龄蛋种五花金鱼。所用蛋种红望天眼金鱼：无背鳍，全身橙红色，眼球成功向上翻转90度；蛋种五花金鱼：无背鳍，红蓝黑黄白色组合花色各异，眼睛上翻程度不一，介于望天和龙睛中间体，具体可见图1。

1.2 试验设备和养殖管理

整个试验在北京市水产科学研究所小汤山水产良种繁育基地室内进行，根据基地现有条件，水深和容器透光性对望天眼影响试验，采用全透光玻璃水族箱和完全不透光塑缸当做试验养殖容器，玻璃水族箱规格为长130 cm×宽 60 cm×高45 cm，支撑悬空离地面，以保证四面缸壁和底面均透光；完全不透光塑缸规格为长120 cm×宽 120 cm×高70 cm。杂交遗传试验，均在玻璃水族箱(长130 cm×宽 60 cm×高45 cm)内进行。

试验养殖期间，统一使用充气装置结合XY-380生化棉过滤器。孵化出幼鱼15 d内投喂活丰年虾虫卵，15～60 d内混合红虫和粉料加水捏成4 cm左右饼状投喂，60 d后投喂2.0 mm浮性颗粒饲料。室内静水养殖，经历春夏秋冬四季自然温度，自然光照，养殖用水为晾晒超过48 h的地下水。整个试验养殖期间，视鱼状态灵活喂食，以保证鱼健康为主。每天用吸便器吸出粪便等脏物，约1个月清洗一次生化棉。使用DR900水质检测仪检测水质状况，控制水质pH 值8.4～7.0 、溶氧9.70～7.70 mg/L、亚硝酸盐小于0.02 mg/L、氨氮小于0.15 mg/L的范围内，视水质状况灵活换水。

1.3 试验设计

1.3.1 水深和容器透光性对望天眼影响试验

(1)前期试验鱼准备：挑选3条红望天眼金鱼(眼睛成功上翻90度)一雄两雌和一条五花雄鱼(眼睛翻转小于45度)，当做亲鱼，进行人工控制混交湿法受精，自然孵化。幼鱼出膜后，移入玻璃水族箱内进行幼苗培育，保持水深30 cm，饲养30天，期间不断剔除畸形、残疾、有背丁和单尾的个体，最终剩余790条。用这790条1月龄仔鱼当做试验鱼进行试验。

(2)设计双因素分组试验：考虑水深和容器透光度两个因素，水深设计15 cm和30 cm两个水平，容器透光度设计全透光和完全不透光两个水平，一共分为2×2四个试验组，每组四个重复。

据此设计方案，考察试验室具体情况，采用8个透光玻璃水族箱和8个完全不透光塑缸当做养殖容器。试验鱼790条根据养殖水体积等密度随机分为4组，每组4个平行重复，具体见表1。第一组标记为A组，玻璃水族箱水深15 cm，每个水族箱约23条仔鱼，4个平行标记为A1、A2、A3和A4；第二组标记为B组，玻璃水族箱水深30 cm，每个水族箱约47条仔鱼，4个平行标记为B1、B2、B3和B4；第三组标记为C组，不透光塑缸水深15 cm，每个缸约43条仔鱼，4个平行标记为C1、C2、C3和C4；第四组标记为D组，不透光塑缸水深30 cm，每个缸约85条仔鱼，4个平行标记为D1、D2、D3和D4。

根据实际生产观察经验，本次所用的两种望天眼金鱼亲本品系孵化出8个月(240 d)后眼睛不再发生变化，即之后眼睛终身保持当时状态，未翻转成功的也不再继续翻转，本试验为确保统计的是金鱼眼睛最终形态，试验饲养金鱼到290 d为止，观察最终金鱼眼睛成功翻转情况，并进行统计分析。

其中需特别说明，C和D组采用70 cm高的完全不透光深塑缸，用来模拟流传中‘深瓮畜养金鱼’环境条件；A和B组采用45 cm高的完全透光玻璃缸，作为对照组；其中设置15 cm和30 cm两个不同水位彼此对照。由于水位和容器底面积不同，每组所需养殖水体积不同，为减少试验误差，本试验采取等密度原则来决定每个容器所投放的金鱼数量。

表1 各组水深和容器透光性

1.3.2 望天眼杂交遗传试验

根据基地现有金鱼情况选取亲鱼，分为三组：蛋种望天眼金鱼(眼睛成功上翻90度)7雌2雄，标记为a组；蛋种偏龙睛五花金鱼(眼睛翻转小于45度)1雌2雄，标记为b组；蛋种偏望天五花金鱼(眼睛翻转大于45度，且小于90度)1雌1雄，标记为c组；各组亲鱼外形具体见图1。

图1 翻眼程度不同的亲鱼组

使用上述亲本，并结合实际生产保存的亲鱼情况，分为6个杂交组，杂交组合见表2，进行人工控制湿法受精，自然孵化。幼鱼出膜后，分别移入玻璃水族箱内，每个杂交组合后代单独进行培育，保持水深30 cm，饲养60 d，期间不断剔除畸形、残疾、有背丁和单尾的个体，保留体型周正健康度较好的个体，继续饲养直到290 d左右，统计每组杂交组合后代的望天率。

表2 不同杂交组合设计

1.4 观察统计方法

饲养试验结束后，进行金鱼眼睛望天率统计，其计算公式如下：

望天率(Celestial eye rate in goldfish,CER)=100%×成功上翻90度的望天眼金鱼数量/总金鱼数量

1.5 数据分析与处理

试验数据以原始数据表示，经过分析处理后以平均值±标准误(mean±SE)表示，试验所得数据用Excel 2007软件统计。首先采用SPSS 17.0软件General Linear Model中的UNIANOVA对试验结果进行‘水深、透光性、水深和透光性互作’三个因素对望天率影响的主体间效应分析，之后采用ONEWAY ANOVA 分别对水深、透光性效应进行单因素分析，显著水平为0.05。并使用SAS9.13软件，调用GLM程序，对不同杂交组合后代望天率进行最小二乘多重比较分析，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 水深和容器透光性对望天眼影响

水深和容器透光性双因素试验，分为四组，每组四个重复，养殖290 d后，统计每组每个重复所得望天率如表3。

表3 不同组所得望天率

对以上数据进行误差方差等同性的 Levene 检验，结果=0.639<0.05，说明所有组中因变量的误差方差均相等假设成立，可执行下一步UNIANOVA分析‘水深、透光性、水深和透光性互作’三个因素对望天率影响的主体间效应，结果如表4，显示水深效应<0.01、透光性效应>0.05、水深和透光性互作效应>0.05，可以说明水深对望天率影响差异极显著，透光性、水深和透光性互作效应对望天率影响不显著。

表4 不同水深和透光性对望天率影响

为直观说明水深、透光性对望天率影响，对水深、透光性分别进行了ONEWAY ANOVA分析，结果如图2。30 cm水深望天率极显著高于15 cm的望天率，而容器透光性则对望天率影响不显著。

图2 不同水深和容器透光性对望天率影响

2.2 望天眼杂交遗传试验结果

由于基地中实际亲鱼雄鱼和雌鱼数量不同，每条雌鱼怀卵量和雄鱼精子量不同，并且发情时间不统一，结合试验设计和实际生产中亲鱼情况，执行了每组不均等杂交试验。各组杂交后代养殖到290天后，统计出各杂交组望天率如表5，对不同杂交组合后代望天率进行最小二乘分析，多重比较结果如图3。

由图3可以看出，第4组杂交组合即望天眼纯繁组的后代中望天率显著高于第1、2和5组，虽然其与第3、6组比较差异不显著，但两者值比较接近0.05，分别为0.071和0.063，即接近于差异显著。其余各组望天率两两比较差异均不显著。说明望天眼纯繁组F1望天率总体显著比杂交组要高，但从图3中可见标准误较大，这说明组内差异也较大，说明每个杂交组内亲本个体间所得后代望天率差异大，实际生产中刚好可从这些差异较大的个体中选出遗传望天率较高的个体，作为下一次繁殖的亲本；同时淘汰遗传望天率较低的个体。因此可以根据表5对每个杂交组合的亲本进行分析选择。

由表5各亲本后代所得望天率，可以分析出亲本中所得望天率较高和较低的个体。其中a1望天眼雌鱼在纯繁组所得望天率97.78%，其与偏龙睛金鱼杂交所得望天率为75%，在各自杂交组合中均属最高，可见其遗传相对比较稳定，有一定母体遗传效应存在，可选作为种鱼用；a3望天眼雌鱼在纯繁组所得望天率57.89%，与偏龙睛金鱼杂交所得望天率为20.67%，在各自杂交组合中均属最低，不可选作为种鱼用，也体现了一定母体遗传效应。另外，结合图3中第1组a♀×b后代望天率(42.40±8.20)%，第2组b♀×a后代望天率(31.82±18.34)%，第3组a♀×c后代望天率(43.90±18.34)%，也可以初步推测望天眼性状一定程度上受母体遗传效应影响。

表5 不同杂交组合所得望天率

图3中第4组a♀×a望天组纯繁后代望天率(85.64±8.20)%，第5组b♀×b偏龙睛组纯繁望天率最低，仅为(8.70±18.34)%；第6组c♀×c偏望天组纯繁后代望天率(42.23±18.34)%，比例介于中间。结果表明亲本翻眼程度越大，其后代望天比例越高，并且可以看出只要亲本眼睛有翻转，无论翻转程度如何，其后代中均会出现一定比例的望天眼，可见望天眼性状受遗传影响较大。

3 讨论

3.1 环境对望天眼金鱼影响

望天眼类，是金鱼品种中较为名贵的种类之一。有报道称在望天眼金鱼发育过程中，伴随着视网膜逐渐不同程度退化，导致望天眼金鱼视线狭窄弱光，游动进食缓慢，望天眼金鱼可以作为研究人类视网膜退化疾病的模型。实际养殖中观察到望天眼金鱼早期其眼睛从外形上看和正常鱼没有区别，随生长发育望天眼性状才逐渐表现出来，有报道望天眼‘背上无鳍，眼球向上生长，它的眼球生长方式，是向上又向前翻转，并不是直接向上，大约孵化后一个月眼球才出现变化’，这与本次试验中观察结果完全一致。另有报道指出望天眼金鱼三月龄眼球突出，四月龄完成翻转向上90度。而本次试验金鱼约二月龄眼球就已经突出，四月龄部分个体翻转成功，与报道的不同，可能是品系和养殖环境不同所致。

望天眼金鱼是龙睛金鱼的变异品种，两者眼睛均与正常眼金鱼视线不同。有推测龙睛金鱼眼睛凸出最有可能是眼内压过高导致。望天眼金鱼眼睛凸出可能也与眼内压过高有关。本试验结果显示30 cm水深比15 cm水深的望天率显著要高，说明外界环境(水深)对望天眼有一定影响，这种差异可能与水压有关，深水位水压大，可能在一定程度上有助于金鱼最终成功翻眼。有文献建议‘望天眼喜好老水绿水，饲养望天眼的池盆，水要比其它鱼深些’，本试验也佐证了这一养殖建议。结合本次试验结果，建议在实际养殖生产中，可以通过加深水位来提高望天眼正品率。

望天眼金鱼的产生，目前有两种观点：(1)完全外界环境影响下形成望天眼。在金鱼的相关著作中有提到望天眼‘据传是由于清朝宫廷采用深缸饲养而促成的’，并认为其培育成形离不开饲养条件和环境的变化。现在很多金鱼爱好者中，也在流传‘深瓮中畜养金鱼，天长日久，因目视瓮口光线而使眼球向上翻，逐渐形成望天眼’。这种观点估计是根据其奇特的眼睛特征而进行的一种推测。(2)基因突变加上持续人工选育产生望天眼。在金鱼相关的著作中提到‘望天鱼只是金鱼突变产生的无数变异中的一种，人们一经发现便捉住它眼球上翻的奇特之处，不断地选择培育而成’。金鱼望天性状是随生长发育而逐渐表现出来，且视线逐渐变弱，因此考虑容器透光性可能对其眼睛生长发育是否影响，同时可以对以上两种观点进行一定程度的验证。本次试验设置不同透光性容器养殖环境，采用不透光且较深容器模拟第一种观点中的深缸养殖环境，并使用完全透光且壁较低的玻璃水族箱养殖作为对比，结果发现容器透光性对其眼睛生长发育影响并不显著，一定程度上说明了第一种观点中“深缸饲养，日久因目视缸口光线而眼球向上促成望天”的流传是不正确的。在本次杂交试验中，发现望天眼性状较为稳定，此结果与第二种观点一致。有研究表明金鱼染色体倍性并不稳定，与相似物种比较，金鱼部分基因或基因簇表现出冗余拷贝现象。根据脊椎动物多倍体祖先二倍体化(2R)学说，这表现出其有可能并没有完成基因组加倍事件。这为金鱼提供了比一般鱼类更加充分的突变机会，且金鱼是以观赏性品种存在，在剧烈的人工选择作用下，其瓶颈效应与奠基者效应加剧，大大缩短了其性状发生突变到稳定的时间。关于望天眼金鱼品系的出现，有报道‘望天眼金鱼于1870年出世，1903年由广东传入日本；推测望天眼金鱼的产生很有可能是金鱼中个别个体突变后，一开始只表现出极少数望天眼，人们发现其奇特外形具有观赏性，而选择对其保留，在高度人工选择繁育下，从后代不断挑选出望天个体，保留再繁育，如此一代代繁育挑选，缩短了其性状发生突变到稳定的时间，较快地形成了性状稳定的望天眼品系。

3.2 遗传对望天眼金鱼影响

望天眼金鱼是龙睛金鱼的变异品种，而望天眼金鱼和龙睛金鱼品种分别出现在不同的时期，又是两种独立的品种。两者同样是眼睛视线有问题，望天眼金鱼发育过程，伴随着视网膜逐渐不同程度退化，导致视线狭窄弱光；而龙睛金鱼眼睛则近视严重。龙睛的遗传规律已经基本清楚。程云生等报道‘正常眼对龙眼为显性’，这个报道里估计仅进行了一代杂交，仅能看出显隐性；王春元等报道龙睛相对正常眼为隐性，符合单基因遗传规律；KON等报道黑龙睛金鱼眼睛突变是由于lrp2aL基因的第45个内含子中有一个13-kbp逆转录转座子插入，而导致终止密码子提前终止了lrp2aL基因的编码。而望天眼的遗传规律和突变机理目前尚不明确。程云生等报道‘朝天眼对正常眼的遗传为隐性’，这个报道里估计仅进行了一代杂交，所以仅能看出显隐性；郭栋进行朝天眼与正常眼兰寿杂交，F1均为正常眼， F2龙睛比例25%，且F2中仅出现极少数的望天，仅可以看出望天眼对正常眼为隐性，且不符合单基因遗传规律。根据实际生产经验观察，杂交生产中会出现很多介于望天和龙睛中间体的个体，即翻眼小于90度的群体，估计上面郭栋报道中所得比例为25%的F2龙睛中，也有部分介于望天和龙睛中间体的个体，只是当时作者把这些个体也当做龙睛来统计而已，F2中翻眼成功的个体极少，显示望天眼可能受多基因调控。在实际杂交生产中会出现很多介于望天和龙睛中间体的个体，即翻眼小于90度的群体，这种现象很常见，但尚未见文字报道，一般在望天金鱼生产选育中会直接淘汰这些个体。本次试验采用这些介于望天和龙睛中间体的个体和望天眼进行杂交试验，以观察其后代遗传表型，结果发现这些介于望天和龙睛中间体的群体，其纯繁后代均可出现部分翻眼成功的望天眼个体；且亲本翻眼程度越大，其后代望天比例越高；可见望天眼性状受遗传影响较大，推测受多基因共同调控。KON等报道了白化望天眼金鱼相对龙睛其lrp2aL基因编码的蛋白氨基酸链更短。因此，lrp2aL基因可以作为研究调控望天眼发育的候选基因之一。

本研究发现望天眼性状一定程度上受母体遗传效应影响，且个体差异较大，其遗传规律与金鱼背鳍性状有些类似。周祺通过对文种与蛋种金鱼杂交，发现金鱼背鳍性状表现出了明显的母性遗传特征，且个体差异明显，并推测金鱼背鳍缺失的现象与环境因素之间的关系密不可分。针对望天眼性状一定程度上受母体遗传效应影响的遗传规律，在实际生产选育应用中，母本的选择对望天眼金鱼育种显得更为重要，这对实际生产选育有积极的借鉴作用。这次杂交试验在群体中a1雌望天眼金鱼个体的后代中望天率最高，可选择留下作为望天眼选育的母本重点养护，但仅有这么一条亲本，对于种质保护和扩繁来说都有难度，因此可尝试通过雌核发育技术对这个亲本进行扩繁，以保留母体性状。本次试验采用介于望天和龙睛中间体的个体和望天眼进行杂交试验，发现这些介于望天和龙睛中间体的群体，其纯繁后代均可出现部分望天眼个体，且亲本翻眼程度越大，其后代望天比例越高。因此，在实际生产中若想培育望天类新品系或对望天新品系改良，在理想亲本实在没有情况下，可以在介于望天和龙睛中间体的个体中，挑选优质且翻眼程度较大的个体当做亲本。

4 结论

通过不同水深和不同容器透光性养殖试验，结果表明金鱼望天眼翻眼成功率受水深影响差异极显著，不同容器透光性对其影响差异不显著，表明金鱼望天眼翻眼成功率一定程度上受环境影响，建议在实际养殖生产中，加深水位以提高望天眼正品率。通过将介于望天和龙睛中间体的个体和望天眼进行杂交试验，观察到亲本翻眼程度越大，其后代望天比例越高，可见望天眼性状受遗传影响较大；并且也观察到望天眼性状一定程度上受母体遗传效应影响。