团头鲂和斑马鱼鳞片的发生发育过程比较研究

王志强，刘 寒，耿瑞静，王卫民

(华中农业大学水产学院，农业部淡水生物繁殖重点实验室，武汉 430070)

鱼鳞作为鱼类重要的皮肤衍生物，由皮肤原始干细胞定向分化而来[1]。鱼类鳞片和鳍条一样，同属鱼类外骨骼，除对鱼体起到保护作用外[2-3]，鱼类鳞片形态结构也是研究鱼类分类特征、生存环境和生长特性的重要依据[4-5]。对于鳞片的发生位置和覆盖过程的研究，不仅可以了解鱼类的生长规律，判断鱼苗生长状况，还能够对鱼类的演化过程和亲缘关系进行探讨和鉴定[6-8]。此外，有研究表明不同物种的鱼类之间的鳞片发育过程差异不大[9]，但其发生的位置和覆盖方式则有很大不同[10-11]。

团头鲂(Megalobramaamblycephala)隶属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)鲌亚科(Culterinae)鲂属，是我国特有的草食性经济鱼类[12]。为合理保护和开发利用团头鲂资源，诸多学者针对团头鲂的早期发育、人工繁殖与养殖等开展了大量研究工作[13-15]。在其鳞片相关研究中，孟庆闻等[16]在对团头鲂相关器官进行观察研究时，对团头鲂鳞片的发育进行了简要概括。熊金林等[17]对低龄团头鲂鳞片上的环纹与生长之间的关系做了探究。但是关于团头鲂鳞片的发生发育过程及与斑马鱼(Daniorerio)的比较研究尚未见报道。本研究主要采用形态学和组织学方法系统地比较研究了团头鲂稚鱼和斑马鱼稚鱼鳞片的发生位置和覆盖过程，初步阐明了团头鲂和斑马鱼鳞片发育的基本规律，探讨了鳞片覆盖与个体年龄和生长的关系，为探讨鱼类鳞片的发育模式提供了丰富的材料，为进一步研究鱼类鳞片发生发育的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验鱼来源与管理

团头鲂亲本均来自湖北省鄂州市国家级团头鲂良种场。经人工授精获得团头鲂胚胎，在25 ℃水温中静水孵化，充氧泵充氧。出膜后仔鱼放入白色塑料盒(80.0 cm×55.0 cm×20.0 cm)中喂养，水温(24.5±0.5)℃。出膜3 d后，开始投喂人工孵化的卤虫无节幼体。出膜14 d后，开始投喂浮游动物，每天早晚各一次。及时清理食物残渣及粪便，每3 d换水一次。

斑马鱼亲本均购自国家斑马鱼资源中心，放入斑马鱼循环系统内养殖。人工配对得到斑马鱼胚胎，收集至玻璃皿中孵化，水温控制在28 ℃，每天换水一次。出膜3 d后转至白色盒子中暂养，开始喂食草履虫，每天早晚各一次。出膜20 d后，转至较大白盒子中，充氧泵充氧。及时清理食物残渣及粪便，每3 d换水一次。

1.2 样本的收集与处理

第一批团头鲂出膜后20 d开始取样一直到出膜后80 d，斑马鱼出膜后25 d开始取样一直到出膜后55 d。每间隔2 d取样一次，每次取样10尾，用4%多聚甲醛固定，其中5尾用于茜素红染色观察鳞片出现的位置及鳞片的覆盖情况，5尾用于组织切片观察。

1.3 鱼体鳞片染色与组织切片观察

鳞片染色的方法结合李思发[11]与鲍宝龙等[18]的茜素红染色法稍作调整，具体如下：(1)将固定于4%多聚甲醛中的标本用ddH2O漂洗30 min，重复3次；(2)用TBST(1 L体积：6 g Trisbase，pH 7.4，8.275 g NaCl，1 mL Trition X-100)温和漂洗，进一步除去残留甲醛和样本脂肪组织；(3)将鱼浸泡在1% KOH中，滴加1% H2O2，强光下照射除去大部分色素，当标本表面出现气泡时终止反应(具体时间根据鱼体大小调整)；(4)待色素去除后，用蛋白酶液(100 mL体系：65 mL ddH2O，35 mL饱和硼酸钠盐，1 g胰蛋白酶)消化肌肉组织，直至鱼体变透明；(5)将透明样本放入1% KOH溶液中，慢慢滴加茜素红溶液(1 g茜素红溶于100 mL 0.5% KOH)，待鱼体表面染成浅紫色为止；(6)将标本放入1% KOH溶液中漂洗，除去多余染液后在体式显微镜下观察、拍照。

对4%多聚甲醛固定的样本进行常规石蜡切片，分别进行H&E和Masson染色，在正置显微镜下进行鳞片发生的组织学观察、拍照。

1.4 数据处理

用鳞片覆盖率(鳞片出现的排数)作为判断鳞片覆盖的指标。应用软件SPSS 17.0对数据进行相关性分析，并绘制鳞片覆盖率与日龄、体长的关系曲线。

2 结果

2.1 鳞片发生的位置及覆盖过程

团头鲂在体长15.5 mm之前未观察到有鳞片出现(图1A)。出膜后24 d，体长达到16.3～19.7 mm时，团头鲂鳃盖后缘侧线处开始出现鳞片(图1B)，之后从该位置沿侧线向尾柄部延伸，同时也沿鳃盖后缘上下扩展，前者的速度要快于后者，并且沿鳃盖后缘向下要早于向上覆盖。出膜26 d，体长达到19.9～20.6 mm时，团头鲂躯干前部的侧线下鳞已覆盖两排，而侧线上鳞还未发现(图1C)。出膜后30 d，体长达到21.1～21.8 mm时，鱼体躯干轴下侧鳞片基本覆盖完全(图1D)。出膜后34 d，体长达到22.3～23.2 mm时，鳞片开始向脊椎上侧发展，尾部侧线以上部位也开始有鳞片出现，并与躯干侧线以上部位出现的鳞片慢慢汇合(图1E)。出膜后44 d，体长达到23.9～24.6 mm时，团头鲂全身鳞片基本覆盖完成(图1F)。

图1 不同发育时期团头鲂鳞片覆盖过程Fig.1 The scales development at different stages of M.amblycephala(A)出膜后第22 d，体长14.54 mm；(B)出膜后第24 d，体长19.62 mm；(C)出膜后第26 d，体长20.33 mm；(D)出膜后第30 d，体长21.55 mm；(E)出膜后第34 d，体长22.80 mm；(F)出膜后第44 d，体长24.12 mm

斑马鱼鳞片的起始位置和覆盖方式与团头鲂有所不同。斑马鱼在体长约6.9～7.1 mm之前未观察到有鳞片出现(图2A)。出膜后39 d，体长达到8.5～9.2 mm时，在斑马鱼尾柄侧线处首先出现鳞片，随后鳞片开始由尾部沿侧线向前开始覆盖，同时侧线上下两侧也开始出现鳞片(图2B)。当体长达到9.7～10.2 mm时，斑马鱼尾部及侧线鳞已覆盖完全，侧线上、下鳞已有1～2排出现(图2C)。当体长达到10.9～11.5 mm时，斑马鱼侧线上、下鳞已出现2～3排，鱼体鳞片总排数达到5排(图2D)。随着鳞片继续沿侧线向上、下扩展，当体长达到11.6～11.9 mm时，斑马鱼体表除腹部以及背部以外，大部分区域鳞片已基本覆盖(图2E)体长达到12.1～12.5 mm时，斑马鱼全身鳞片覆盖完全(图2F)。

图2 不同发育时期斑马鱼鳞片覆盖过程Fig.2 The scales development at different stages of D.rerio(A)出膜后第33 d，体长7.04 mm；(B)出膜后第39 d，体长8.96 mm；(C)出膜后第45 d，体长9.93 mm；(D)出膜后第45 d，体长11.30 mm；(E)出膜后第43 d，体长11.63 mm；(F)出膜后第47 d，体长12.20 mm

2.2 鳞片发生的组织学观察

为了清楚地研究团头鲂和斑马鱼鳞片发生的主要过程，实验采用不同的组织切片染色方法，即H&E染色和Masson染色对其进行了观察，结果表明团头鲂的鳞片发生过程主要经历了以下几个阶段：

形态发生早期：成纤维细胞在表皮的生发层下聚集(图3A，图4A)，随着成纤维细胞在表皮与真皮临界处的大量出现，形成一层单独细胞层(图3B，图3C，图4B)。

形态发生晚期：在表皮与真皮临界处的成纤维细胞继续分化成更大的细胞，开始形成鳞片乳突(图3D，图4C，图4D)。

分化早期：鳞片乳突不断分化成为两层鳞片生成细胞，并不断分泌骨质，形成骨质薄片即为鳞片原基(图3E)。鳞片上下层出现新的真皮细胞层，形成包围鳞片的小囊，即鳞囊(图3F，图4E，图4F)。

分化晚期：鳞囊继续扩大，鳞片基质更加明显(图3G，图4G)。

图3 团头鲂稚鱼鳞片发生的组织结构(H&E染色)Fig.3 The histology of scales development in juvenile M.amblycephala(H&E staining)(A-C)形态发生早期：(A)皮肤的表皮和真皮；(B)成纤维细胞开始在表皮层发生聚集；(C)成纤维细胞进入真皮层中部；(D)形态发生晚期：成纤维细胞堆积形成乳突；(E-F)分化早期：(E)鳞片乳突不断分泌骨质，鳞片原基形成；(F)鳞囊形成；(G)分化晚期：鳞囊继续扩大，鳞片基质更加明显；(H)折叠期：表皮在鳞片末端折叠，鳞片形成ep：表皮；de：真皮；fb：成纤维细胞；bc：基底细胞；el：外层细胞；ef：弹性纤维；scp：鳞片乳突；sfc：鳞片形成细胞；sp：鳞囊；sc：鳞片

图4 团头鲂稚鱼鳞片发生的组织结构(Masson染色)Fig.4 The histology of scale development in juvenile M.amblycephala(Masson staining)

折叠期：表皮开始在鳞片后端边缘折叠，鳞囊进一步扩大，相邻的鳞片发生重叠，形成成熟的鳞片(图3H，图4H)。

经研究发现，斑马鱼的鳞片发生过程与团头鲂基本相同，也主要经历了形态发生早期、形态发生晚期、分化早期、分化晚期和折叠期，共五个时期，各个发育时期的具体变化与团头鲂相同，详见图5、图6。

图5 斑马鱼稚鱼鳞片发生的组织结构(H&E染色)Fig.5 The histology of scales development in juvenile D.rerio(H&E staining)A-B形态发生早期：(A)成纤维细胞开始在表皮生发层聚集；(B)成纤维细胞进入真皮层中部；(C)形态发生晚期：成纤维细胞堆积形成乳突；D-E分化早期：(D)鳞片乳突不断分泌骨质，鳞片原基形成；(E)鳞囊形成；F-G分化晚期：(F)鳞囊继续扩大，鳞片基质更加明显；(H)折叠期：表皮在鳞片末端折叠，鳞片形成。

图6 斑马鱼稚鱼鳞片发生的组织结构(Masson染色)Fig.6 The histology of scales development in juvenile D.rerio(Masson staining)

2.3 鳞片覆盖与体长和日龄的关系

鳞片覆盖率(coverage rate，CR)指标，与体长(body length，L)和出膜后的日龄(days post hatching，D)的关系如图7所示。团头鲂鳞片覆盖率与体长的关系为CR=-0.000 7L3+0.040 3L2- 0.683 3L+3.560 1(R2=0.794 5，P=0.000)(图7A)；团头鲂鳞片覆盖率与日龄的关系为CR=0.000 0D3- 0.000 3D2+0.039 0D- 0.684 5(R2=0.412 9，P=0.000)(图7B)。通过SPSS 17.0软件计算得到团头鲂鳞片覆盖率与体长的相关系数为0.864，相关性较强(r=0.864，P=0.000)，团头鲂鳞片覆盖率与日龄相关系数为0.609，成弱相关性(r=0.609，P=0.000)。斑马鱼鳞片覆盖率与体长的关系为CR=-0.004 8L3+0.162 1L2- 1.609L+4.951 7，(R2=0.803，P=0.000)(图7C)；斑马鱼鳞片覆盖率与日龄的关系为CR=-0.000 3D3+0.029 5D2- 1.059 9D+12.169(R2=0.524 5，P=0.000)(图7D)。斑马鱼鳞片覆盖率与体长的相关系数为0.858，呈强相关性(r=0.858，P=0.000)，斑马鱼鳞片覆盖率与日龄相关系数为0.603，呈弱相关性(r=0.603，P=0.000)。

图7 团头鲂(A和B)和斑马鱼(C和D)稚鱼鳞片的覆盖率与体长、日龄的关系Fig.7 Variation in areal coverage of scales by body length and age during development in juvenile M.amblycephala(A and B)and D.rerio(C and D)

3 讨论

3.1 鱼类鳞片发育的起始位置和数量

鱼类鳞片的发生发育是一个非常复杂的过程，不同鱼类的鳞片发育模式不尽相同。本研究结果显示，团头鲂鳞片最先起始于鳃盖后缘侧线处，这种鳞片起始位置与鲤科鱼类的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[11]、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)[11]、鲤(Cyprinuscarpio)[11]、鳙(Aristichthysnobilis)[11]、重口裂腹鱼(Schizothoraxdavidi)[19]和齐口裂腹鱼(S.prenanti)[20]的鳞片起始位置一致。而斑马鱼的鳞片起始位置与团头鲂的鳞片起始位置明显不同，其为尾柄侧线处，这与小孔亚口鱼(Minytremamelanops)[8]、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)[11]、莫桑比克罗非鱼(O.mossambicus)[21]、奥克兰鳗鲡(Anguillaaustralis)[22]、大鳗鲡(A.dieffenbachii)[22]的鳞片起始位置一致。此外有些鱼类鳞片起始位置并不属于以上两种类型，如梭鱼(MugilsoiuyBasilewsky)[5]、河川沙塘鳢(Odontobutispotamophila)[23]、暗斑棘盖太阳鱼(Pomoxisnigromaeulatus)[24]鳞片最早出现于尾柄侧中央至体侧中央的连线上，又如乌鳢(Channaagrus)[25]出现在头顶部，条石鲷(Oplegnathusfasciatus)[26]出现在鳃盖后缘至胸鳍基部，黑鲷(Sparusmacroeephlus)[27]出现在胸鳍基部至肛门直上方的侧线处。本实验结果显示，团头鲂和斑马鱼鳞片起始中心数量均只有1个起始中心。与草鱼、鲢、鲤、鳙、尼罗罗非鱼[11]、莫桑比克罗非鱼[21]、河川沙塘鳢(O.potamophila)[23]、小孔亚口鱼[8]、奥克兰鳗鲡[22]、大鳗鲡[22]、黑鲷[27]鳞片起始中心数量一致。澳大利亚虎鲨(Heterodontusportusjacksoni)[28]有2个，梭鱼[5]、暗斑棘盖太阳鱼[24]、条石鲷[26]有3个，乌鳢[22]有4个，重口裂腹鱼[19]和齐口裂腹鱼[20]有6个。

由此可见鱼类鳞片的起始位置以及起始中心数量在不同鱼类中差异明显，即便是同科的团头鲂和斑马鱼的鳞片起始位置和覆盖方式均有很大差异。严太明等[19-20]指出鱼类鳞片起始位置在物种间差异较大，具有种属特异性；但是鳞片起始位点的个数，不同物种差异较大，规律性不强。

3.2 鱼类鳞片的覆盖与生长

利用鳞片覆盖率来描述鳞片覆盖的程度。对于鳞片较小、数目不清楚的鱼类，如鲢、鲤、乌鲤、鳙等，习惯用鳞片覆盖面积来进行覆盖率的描述。但对于鳞片较大、数目清楚的鱼类，如草鱼、梭鱼等，经常用鳞片出现的排数来描述覆盖程度。本研究中的实验对象团头鲂和斑马鱼的鳞片均清晰明了，故采用后一种方法来对鳞片的覆盖程度进行描述比较。

诸多研究结果表明，鱼类鳞片的发生与鱼类的生长存在密切联系。本实验中团头鲂、斑马鱼的体长和日龄与鳞片覆盖率均有重要影响，但相比之下体长与鳞片覆盖率的相关性更强。这与已有研究结果一致。李思发[11]对鲤、草鱼、鲢、鳙和尼罗罗非鱼的研究结果表明，这几种鱼类的鳞片发育主要决定于体长，体长越长，鳞片越多。对重口裂腹鱼[19]、齐口裂腹鱼[20]鳞片的研究结果表明，体长和日龄对鳞片的覆盖率均具有重要影响。这些研究结果说明了鱼类鳞片发育过程可能与体长、日龄有一定关联。在鱼类的生长发育过程中，环境因子存在不可忽视的作用，同样作为鱼类生长发育的一部分，鳞片的形成也受到环境因素的影响[26]，比如饵料、水温、密度大小等。

3.3 鳞片发生组织学研究

本实验通过对团头鲂、斑马鱼皮肤切片染色的观察发现。两者与其他真骨鱼类骨鳞的发生并无很大差别，均要经历真皮基质的形成，鳞片的乳突的出现、鳞囊的分化和基质沉积的过程[2，19]。这表明，不同鱼类鳞片发生的起始位置、覆盖方式差异明显，但鳞片发育的组织学过程基本一致。由于鱼类真皮和表皮中富含结缔组织和胶原纤维，本研究中对皮肤组织切片不仅运用了传统的HE染色，还运用了对胶原纤维具有良好显色效果的Masson染色。通过两种显色结果的比较，从而更准确地观察到团头鲂和斑马鱼鳞片发生的组织学过程。这也为以后利用模式生物从分子水平研究鱼类鳞片发生机制奠定了基础。