淡水鱼类对低氧的抗氧化防护响应

赵燕静，狄桂兰，蒋昕彧，李 慧，孔祥会

( 河南师范大学 水产学院，河南省水产动物养殖工程技术研究中心,水产动物疾病控制河南省工程实验室,河南 新乡 453007 )

低氧； 淡水鱼类； 氧化应激；抗氧化防护

氧气对需氧生物的生存至关重要。同一分压下，水中氧含量仅为陆地空气氧含量的1/30，水生脊椎动物氧的可利用性比陆生动物更重要。此外，氧气在水中的扩散速度只有空气中的1/10 000[1]。所以，无论是生物或非生物过程中引起氧的可利用性或氧消耗变化，均显著影响水环境中溶解氧的含量变化。因此，大多数海洋、河口和淡水较容易发生连续或慢性的低氧现象。低温下淡水水体表面结冰，限制了大气中氧扩散进入水体，或者由于热梯度而造成水体垂直分层，限制了表面水和深层水的交换，加剧了淡水水域的缺氧现状[2-3]。因此，水体中溶氧含量较低，扩散速度较慢，变动幅度较大，较易受其他因素影响，相对于陆生动物来说，水生动物尤其是淡水动物，更易受到低氧的胁迫[4]。

在水产养殖中，鱼类可利用的溶解氧水平是水质常规监测的关键变量之一，也是影响鱼类生长发育、行为代谢和免疫的最重要因素之一[5-7]。溶氧含量的变动不仅受水温、盐度、水流速度、昼夜变化等的影响，表层和底层水的交换、水体的垂直分布、藻类光合作用速率和有机物呼吸强度变化也会影响溶氧量的变动[8-9]。低氧胁迫不仅制约鱼类生长，还影响鱼类的先天性免疫，引起鱼体的氧化应激反应，抗病力和免疫力下降，增加对病菌的易感性[10-11]。一般情况下，溶解氧质量浓度需维持在4 mg/L以上，鱼类才能正常生长；当溶解氧水平低于2 mg/L时，一般养殖鱼类会浮头，长期浮头影响鱼类生长；若溶解氧质量浓度低于1 mg/L时，鱼就会严重浮头以致窒息死亡。高密度养殖下，鱼类易受到低氧胁迫[12]。人类活动也会造成水体富营养化，使鱼类遭受低氧胁迫。因此，了解鱼类低氧胁迫响应及作用机制对指导水产养殖水质调控具有重要的意义。

1 鱼体中的氧化应激反应

需氧生物中氧分子作为线粒体呼吸链电子的最终受体，参与氧化磷酸化反应，以支持氧的代谢过程，代谢中约有10%～15%的胞内氧分子作为单氧酶、加氧双酶、氧化酶和过氧化物酶等催化反应的基质而被消耗[13-16]。因此，低氧不仅影响氧化磷酸化反应, 还影响许多胞内相关的需氧反应。低氧环境下鱼类有氧呼吸速率下降，氧化磷酸化作用突然降低, 使呼吸链的电子流到达复合体Ⅳ时停止，引发电子流返回到复合体Ⅲ/Ⅰ，导致产生的活性氧自由基种类增加[17]。因此，低氧环境可促使鱼体内活性氧种类，如超氧阴离子自由基、过氧化氢和羟基自由基增加[18]。细胞有氧呼吸会产生活性氧种类，如通过单价途径产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基继续被还原为过氧化氢，接着过氧化氢还原为羟基自由基，最终还原为羟离子和水[19]。

正常生物体内，活性氧自由基种类的产生和清除处于一个动态平衡。当活性氧自由基产生过多时，超过鱼体自身的清除能力，多余的活性氧自由基便会氧化生物大分子，如蛋白、核酸、类固醇及细胞膜中的不饱和脂肪酸等，产生不稳定的过氧化物[20]，破坏细胞结构的完整性，造成氧化损伤，使其功能紊乱，导致多种疾病发生。此外，这些脂质过氧化产物再次分解为氧自由基，使脂质过氧化链式反应恶性循环[21]。活性氧自由基还可作为第二信使对一些转录因子和信号转导因子，如热休克诱导因子、核酸因子、细胞循环基因p53、促分裂原活化蛋白激酶、 oxyR基因产物的表达调节具有重要作用[22-24]。研究发现，氧化应激可通过细胞循环因子参与细胞凋亡和细胞坏死过程。

缺氧引起许多鱼类，如虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[25]、斑点叉尾(Ictaluruspunctatus)[11]、欧亚鲈鱼(Percafluviatilis)[3,26]、鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)[27]、鲤鱼(Cyprinuscarpio)[28]、银鲇(Rhamdiaquelen)[29-30]、三刺鱼(Gasterosteusaculeatus)[31]等的氧化应激反应，对于鱼类生化、生理、生长发育、繁殖、行为、代谢、免疫等产生不利影响[16,32-34]。为了能在低氧环境下生存，鱼类已进化形成了一系列的适应策略，如行为方面，通过改变游泳速率和呼吸方式、减少捕食来适应低氧坏境[35-39]；形态方面，改变鱼鳔的形态和大小[40]，通过鳃小片突出改变鳃的形态来增加呼吸表面积[41-44]；代谢方面，通过降低三磷酸腺苷消耗和需氧代谢率，增强厌氧代谢等方式以减少鱼体的氧化损伤[28,32]；鱼类还会激活抗氧化防御系统[17,30,45]和改变相关基因的表达[16，27,46]来应对低氧环境。

2 低氧下淡水鱼类抗氧化防护的响应

1986年, Reischl[47]首次揭示了低氧耐受与抗氧化防御之间具有相关性，低氧环境诱导鱼类使用厌氧途径，促使活性氧产生增加，而内源性抗氧化防御系统可清除细胞内多余的氧自由基，在保护细胞免受氧化应激方面起至关重要的作用[48]。该系统由抗氧化酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶)和小分子抗氧化剂(类胡萝卜素、维生素、谷胱甘肽、硫氧还原蛋白)组成。超氧化物歧化酶是降解活性氧自由基的第一道防线，可将超氧阴离子自由基转化为过氧化氢；然后由过氧化氢酶将过氧化氢转化为水和氧气；谷胱甘肽过氧化物酶可清除胞内过氧化氢和有机过氧化物[17]。

2.1 抗氧化酶

2.1.1 超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶，由McCord等[49]最先发现，是一种天然金属酶，广泛存在于动植物及微生物中，可消除细胞产生的活性氧自由基，是鱼体抗氧化防护的第一道防线；对维持鱼体内环境稳定和天然免疫具有重要生理功能。根据金属蛋白的不同，通常分为铜锌超氧化物歧化酶、锰超氧化物歧化酶、镍超氧化物歧化酶和铁超氧化物歧化酶4种类型[50]。目前，在鱼类中仅发现了铜锌超氧化物歧化酶和锰超氧化物歧化酶，广泛研究了其基因结构和在淡水鱼类中的功能，发现它们可使鱼体降低或免受氧化应激的损伤。

低氧下鲢鱼肝胰脏铜锌超氧化物歧化酶和锰超氧化物歧化酶的mRNA表达量均显著下调[27]，表明低氧环境促使活性氧自由基产生增加，超过鱼体自身清除能力，使鱼体活性氧自由基积累,以导致氧化应激；大头兔脂鲤(Leporinusmacrocephalus)[51]、胡鲇(Clariasbatrachus)[52]低氧处理后肝胰脏组织超氧化物歧化酶活性变化与鲢鱼相似。然而，鲢鱼鳃中铜锌超氧化物歧化酶和锰超氧化物歧化酶的mRNA表达量均显著上调[27]，低氧下胡鲇[48]和平口鲳鱼(Leiostomusxanthurus)[53]鳃组织中超氧化物歧化酶活性显著上升；这表明低氧下超氧化物歧化酶 mRNA的表达具有组织特异性，超氧化物歧化酶活性变化具有物种特异性或组织特异性。

2.1.2 过氧化氢酶

过氧化氢酶又名触酶，是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶。对过氧化氢具有高亲和性，以过氧化氢为底物, 通过催化一对电子的转移而最终将其分解为水和氧分子，可清除体内较高含量的过氧化氢，在食品、医药、纺织、造纸、环保等行业具有重要的作用。过氧化氢酶具有光高敏感性，见光易分解，这可能是由于血红素对光的吸收造成[20]。按照结构和序列水平的异同，将过氧化氢酶划分为3个亚群[54]，即单功能过氧化氢酶(典型过氧化氢酶)、双功能过氧化氢酶和锰过氧化氢酶。按照催化中心结构差异过氧化氢酶可分为两类：含铁卟啉结构的过氧化氢酶(又称铁卟啉酶)和以锰离子替代卟啉结构中铁离子的锰过氧化氢酶。目前，在淡水鱼类中仅发现典型过氧化氢酶。

葛氏鲈塘鳢(Perccottusglenii)在低氧胁迫后，脑组织的过氧化氢酶活性显著升高，肌肉组织的过氧化氢酶活性显著下降，而肝脏组织的过氧化氢酶活性未见明显变化[55]；而金鱼(Carassiusauratus)在缺氧8 h后肝胰脏过氧化氢酶活性显著升高，但脑和肌肉中过氧化氢酶活性保持不变[56]，显示低氧对过氧化氢酶活性的影响具有组织特异性和物种特异性。胡鲇在低氧处理后过氧化氢酶活性变化也呈现出明显的组织特异性[52]。不同鱼类对低氧响应的差异是长期对环境适应和进化的结果。

2.1.3 谷胱甘肽过氧化物酶

谷胱甘肽过氧化物酶是一类多酶家族的统称。它可以消除体内的过氧化氢及脂质过氧化物，阻断活性氧自由基对机体的进一步损伤，是生物体内重要的活性氧自由基清除剂。根据包含的硒代半胱氨酸的不同，可将谷胱甘肽过氧化物酶分为含硒和不含硒两大类。根据分布和催化底物的不同，含硒谷胱甘肽过氧化物酶又分为4个亚型，即典型谷胱甘肽过氧化物酶、胃肠型谷胱甘肽过氧化物酶、血浆型谷胱甘肽过氧化物酶和磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶[57]。

金鱼低氧处理8 h后，脑中谷胱甘肽过氧化物酶活性显著上升，但肝胰脏和肌肉中谷胱甘肽过氧化物酶活性未发生明显变化[56]；鲤鱼低氧(0.9 mg/L)胁迫5.5 h后，脑谷胱甘肽过氧化物酶活性显著升高[58]，与金鱼低氧下脑中谷胱甘肽过氧化物酶活性上升的结果一致；然而，Mustafa等[59]研究显示，鲤鱼肝胰脏和鳃在低氧(1.8 mg/L)下处理30 d后，谷胱甘肽过氧化物酶活性未明显变化。这些研究结果表明，低氧对谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响不仅具有物种特异性和组织特异性，还与低氧暴露的含量和时间有关。葛氏鲈塘鳢[55]脑中谷胱甘肽过氧化物酶活性未发生明显变化，与金鱼肝胰脏和肌肉的结果一致，说明在应对低氧胁迫时，并不是所有鱼类都会发生抗氧化酶活性升高。

2.2 非酶抗氧化剂

非酶抗氧化剂主要包括抗坏血酸、谷胱甘肽、生育酚、类胡萝卜素、尿酸等小分子抗氧化剂[48]。抗坏血酸为多种活性氧自由基的还原剂，不仅可以清除过氧化氢，还可以清除超氧阴离子自由基、羟基自由基和脂质过氧化物，在降低氧化应激对机体损伤中具有重要作用。生育酚(即维生素E)，主要通过清除单态氧和过氧化物发挥抗氧化性能。维生素E可妨碍大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)鱼卵的脂质过氧化过程，增强其抗氧化保护性能[60]；类胡萝卜素是一种脂溶性分子，是一种有效的活性氧自由基清除剂，可降低氧化损伤的程度而保护鱼体[61]。目前，低氧对淡水鱼类小分子抗氧化剂的影响研究大多是关于谷胱甘肽，尚未发现关于其他非酶抗氧化剂的报道。

谷胱甘肽为一类小分子抗氧化剂，参与一系列至关重要的细胞保护功能，包括消除氧自由基，解毒亲电体，维持巯基—二硫键的平衡和信号转导等。研究显示，还原型谷胱甘肽在鱼类应对氧化压力中起重要作用[9]，是谷胱甘肽过氧化物酶发挥反应的基质，主要通过与氧分子、超氧阴离子自由基和羟基自由基反应发挥其抗氧化功能。当出现氧化压力时，谷胱甘肽的合成重新开始，在氧化状态下谷胱甘肽可形成硫自由基，与另一个氧化状态的谷胱甘肽反应形成二硫键，即氧化型谷胱甘肽，还原型/氧化型的比率经常作为细胞氧化应激的指标。缺氧下金头鲷(Sparusaurata)肝脏中还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量显著降低[62]，说明低氧对肝脏组织造成氧化损伤，影响还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的正常功能；低氧下银鲇脑中还原型谷胱甘肽含量显著上升，而在肾脏中未发生明显变化[29]；在低氧下尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)[63]和胡鲇[48]肝脏组织中还原型谷胱甘肽含量的变化与银鲇肾脏中还原型谷胱甘肽结果相似，均未发生明显变化，这表明鱼类在应对低氧引起的氧化应激时，小分子抗氧化剂并不总发生变化。

3 小结与展望

大量研究显示，低氧对鱼类抗氧化酶活性和非酶抗氧化剂的影响具有多样性，这可能与鱼的种类、生长发育阶段、组织器官、低氧水平和暴露时间有关。低氧胁迫下，大多淡水鱼类抗氧化酶活性和小分子抗氧化剂水平均发生显著变化，但也有些鱼类变化不明显，表明不同鱼类在应对低氧引起的氧化应激时，抗氧化酶活性变化不同。淡水鱼类应对低氧压力所表现出的抗氧化酶多样性变化的机制尚不清楚。目前，广泛研究了低氧对鱼类抗氧化防护的影响，但大多研究关注于抗氧化酶活性或mRNA表达的变化。关于抗氧化酶超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶对低氧的响应信号调节以及抗氧化通路的报道较少，应加强这方面的研究，以揭示低氧下抗氧化防护作用及信号调节的分子机制。