（三）环境因子对鱼类精子活力影响的机理

精子的运动靠鞭毛的摆动，其能量来自ATP水解所释放的能量。关于水环境中各种因子对鞭毛摆动的作用途径，目前有下列假说：

一是Ca2＋说，认为K＋/H＋的离子浓度比使Ca2＋进人精子内，激活腺苷酸环化酶，使ATP转化成cAMP，进而激活蛋白激酶，使15 KD蛋白质被磷酸化，引起精子运动。

二是电动势说，认为海水鱼精子的膜电动势通常是固定值。当外界环境中离子或pH值发生变化时会引发膜电动势的变低。当这一变化达到一定值时，就会使精子运动。

Ca2＋说能解释某些实验现象，但缺乏普遍性；电动势说对各种离子之间相互影响可以得出统一解释，但许多实验表明，精子运动时伴有体内Ca2＋浓度的瞬间升高。综合上述两种假说，提出了第三种分子机制说，认为精子膜中分布着钠泵、钾泵、钙泵等ATP水解酶。当外界环境中的精子浓度发生变化时，精子通过这些离子泵来维系细胞内的离子平衡和电荷平衡。当各种离子浓度的变化超过一定限度时，精子通过改变细胞质中Ca2＋的浓度来维持上述平衡。细胞质中的Ca2＋浓度可以通过线粒体调节。Ca2＋进人线粒体以后与磷酸根离子和（或）特异的蛋白质结合。磷酸根的浓度降低，诱导AMP降解；蛋白质本身是AMP环化酶的拮抗物。这种蛋白质浓度降低时ADP转化成cAMP，而ADP浓度的降低又促使ATP降解。ATP降解时产生大量能量，供精子运动之需。

（四）精液的保存

了解了鱼类精子的生物学特点，不仅能科学地进行人工授精，准确地分析授精的效果，还能利用精子在低温和原液条件下代谢水平低、寿命长的特点，长期保存精液。利用保存精液和卵子技术可以贮藏具有优良性状的遗传物质，解决亲本不足或性成熟不同步及育种等问题。鱼类精液的保存包括低温保存和超低温保存两种：前者指将精液保存在10℃～15℃（一般为0℃左右）的温度中，后者指保存在-196℃的液氮生物容器中，受精前需解冻。

鱼类精液保存技术的要点有以下几方面：

1、亲鱼的选择

经鱼类种质的鉴定，符合种质鉴定标准，达到性成熟年龄、体质健康的雄亲鱼方能用做采精的亲鱼。

2、采精

先把鱼体表的水擦干净，用干燥洁净的玻璃注射器或轻轻用手将精液吸入或挤入经消毒干燥的试管或小瓶中，避免阳光照射，最初几滴精液挤掉不要。挤完后将容器加塞封好，放人暖水瓶中，加上半瓶冰块。塞紧即可（最好逐渐加冰，使温度缓慢下降）。用这种方法，在0℃~2℃时可使鲤精子存活 144～241 h；2℃~6℃时可使鲢精子存活264 h。

3、精液质量检查

用解剖针挑取少许鲜精液置于载玻片上，滴加自来水或池水后立即在显微镜或倒置显微镜下观察和记录精子的活力和运动时间。精子的活力标准分为五级：激烈运动（涡动）、快速运动、慢速运动、摇摆运动、死亡。鲤科鱼类选乳白色、精子比容在55%～65%之间、密度达250~400亿精子/毫升、激活率达85%以上的鲜精液用做保存。

4、精子延寿剂

延寿剂指在精液保存过程中有利于延长精子寿命的物质，包括精液稀释剂、抗生素、氧气、抗冻剂等。精液中加入稀释剂后，可延长保存时间，便于受精操作，控制保存效果。为了得到良好的保存效果，精液中需加稀释剂和防冻剂。稀释剂又称扩展剂。不同鱼类精液的最适稀释剂有所不同，但它们均以鱼类生理盐水为基础，模拟精液的组成成分，添加各种营养物质和稳定剂。稀释液的pH值应与鱼类精液的pH值接近，一般在6.5～7.5之间；渗透压在300毫渗左右。

配制稀释剂的原则是：①稀释剂的成分应对精子无毒、无害、无副作用。②能抑制精子运动，使其保持原来的静止状态。精子的运动既与外界水环境的渗透压及离子，尤其是钾离子的浓度有关，也与鱼类种类有关。对大多数淡水鱼来说，低渗透压是激发精子运动的主要因素，因此，配制淡水鱼精液稀释剂时，其渗透压应等于或高于精浆渗透压。海水鱼则相反，其稀释剂的渗透压应等于或稍低于精浆渗透压。鱼类精浆的渗透压一般为250-300 mosm/kg。③精子在低温下仍有少许运动，稀释剂中应含一定的营养物，如葡萄糖、卵黄、蜂蜜、牛奶等。④应具有一定的缓冲能力，使稀释的精液具有较稳定的pH值。表4-5列出了一些养殖鱼类精液稀释剂的配方。不同鱼类精液与稀释剂适宜比值为：鲤科鱼类1：1～1：4；鲑科鱼类1：4～1：9。稀释剂与精液混合时必须等温。

为避免微生物污染，精液保存中必须添加抗生素。常用的抗生素及其剂量为：青霉素5000 IU/ml精液；硫酸新霉素l mg/ml精液；青霉素1000 IU/ml十链霉素5000 IU/ml精液；金霉素0.6 mg/ml精液。

主要养殖鱼类精液稀释剂配方（g/L）

鱼类人工繁殖

精子在低温状态下仍要代谢耗氧。若将精液装入密闭容器中，不接触空气，只能保存很短时间；若把装精液的容器敞开，虽可延长保存时间，但精液会蒸发干燥，并招致微生物污染，因而应向密闭容器中通入湿润氧气。这样既为精液提供了氧气，又可密闭容器，避免蒸发和污染。充入的氧气可先通过蒸馏水再进入容器，以免精液干燥。保存精液的容器要足够大，留有一定空间。封闭瓶中精子和空气之比为1：10～l：20较宜。

5、抗冻剂

一般认为，在0℃以上保存精液不需加抗冻剂，但只能保存几天，最多十几天。在0℃以下或超低温（-196℃）下，精液虽可长期保存，但冷冻和解冻过程中的一系列理化变化，会对精子造成损伤。因此，长期保存精液就必须添加防冻剂。精液的成分大部分是水，精液超低温保存的关键主要取决于水的性质。温度低于精液冰点时水开始结冰，冰点至-60℃是形成有序状态冰晶的温度区。细胞内冰晶的形成会机械损伤细胞结构；细胞外结冰会导致细胞失水，使细胞变形、破裂死亡。当温度低于-60℃时，有序状态的冰晶减少；当温度低于-130℃时，水分子停止运动，保持原来的无序状态，形成坚硬、均质的四块结构，这种现象叫玻璃化。玻璃化状态的精子不会出现原生质严重脱水的现象而使细胞保持完整结构，精子解冻后即可恢复运动能力。因此，精液超低温保存就是通过添加适当的保护剂和增加冷冻速度。使精子安全越过冰晶形成区，进入玻璃化状态，避免严重脱水和低温损伤，以便长期保存。由于这种玻璃化状态不稳定，温度回升至-60℃以上时，会发生次级结晶，因此，冷冻精液需置于液氮中长期保存。

常用的鱼类精液抗冻剂有二甲亚砜（DMSO）、乙二醇或甘油等，另外卵黄、蜂蜜、葡萄糖和牛奶等也有一定的抗冻作用。鲤、鲢、团头鲂和草鱼的精液经 8%DMSO处理后，渗透压增加至 1369 m Osm/L，谷草转氨酶活性显著增高，其精液冰点下降至-3.9℃。以 1%NaCI和0.05%KCI为基础溶液，添加不同浓度的抗冻剂，结果表明，10%甘油加10%DMSO冷冻保存黑鲷、花鲈和大弹涂鱼精液的效果最好。

抗冻剂可一次加入或分次加入，边加边轻轻摇动，混合均匀，加入速度要慢，特别是甘油，以 2～3滴/min为宜。在常温下应尽量减少抗冻剂与精子的接触时间。先将稀释剂与DMSO按比例混合后，放入O℃～4℃冰箱中预冷，再将精液与预冷的抗冻稀释剂按1：2～1：3的比例稀释，再在0℃～4℃冰箱中平衡10～30 min液氮低温（-196℃）保存精液，要先初冻（-90℃~～110℃）。液氮保存精液常用下列两种方法：

小球法：将已加入了稀释剂和防护剂的精液滴于液氮蒸气上或二氧化碳干冰上，做成小球，约一分钟后将小球放入 0.5 ml～lml的小安瓿瓶或塑料瓶中，放于液氮中保存。也可将铜沙网或铜板、铝板置于液氮面上，再将精液稀释剂滴于其上成滴冻颗粒，然后收起装瓶，放入液氮中保存。

小瓶法：将已稀释的精液置于5 C冰瓶内平衡30～50 min，然后装入小瓶，每个链霉素小瓶装 4ml。将小瓶置于液氮蒸气上初冻，小瓶距液氮面1cm～2 cm，15 min后放入液氮中保存。

（1）贮存

容器内的液氮必须浸没冻精。应经常检查容器内液氮量和液氮容器的状况，如发现异常，应立即将冻精转移到其他完好的容器内。贮存的精液应做好记录。

（2）冻精解冻

将冻精颗粒包装提至液氮蒸气中平衡5 min，然后迅速取出冻精颗粒，放入25℃～30℃的解冻液中。如采用小瓶法保存，解冻时将器皿提至液氮罐口下平衡 5 min，然后迅速将安瓿瓶取出，放入30℃～40℃的温水浴中，轻轻摇动，使温度均匀，待只剩一点冻屑时立即取出。在室温（25℃）或温水（39℃）中转动小瓶，融解冰冻保存的精液。

（3）受精

融解后的精液应立即与卵子混合受精。受精前可用O.8%～1.5%的氯化钠溶液激活保存的精液中的精子，在显微镜下检查精子的活力。冻精受精率的高低，一方面取决于解冻后精子的活力，即活力强，受精率高。这已为许多实验证实。另一方面，也与精子的数量有关。在精子成活率相似的条件下，适当增加冻精量，也会提高受精率。因此，确定适宜的精子和卵子数量比，以便既不浪费冻精，又能获得较高的受精率，这是个重要问题。研究表明，人工受精时精卵的数量比以3万～4万/卵为宜，即每ml家鱼精液可以使50万～100万粒卵受精。海水鱼类这方面的研究尚需加强。