鱼类精液保存技术
发表时间:2017/11/22 00:00:00 作者:韩永望 浏览次数:2279
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一、常温保存
在常温条件下，将鱼类精子处于等渗环境中，减少精子用来调节渗透压平衡的能量消耗而延长精子的寿命。在人工授精操作过程中，用生理盐水代替淡水，可提高受精率。
二、冷藏保存
冷藏保存是利用普通冰箱的冷藏室(0~4℃)保存鱼类精液，这种方法可保存精液达数天至数十天，如果在精液中加入合适的稀释液，同时将冷藏室的问题调低，保存时间更长。冷藏保存时精子有微弱的代谢需要消耗氧气，因此在保存时应保持一定的空气或氧气。精液冷藏保存时,抗生素是必不可少的。常用的抗生素有：青霉素，5000IU/ml精液；硫酸新霉素，1mg/ml精液；青霉素1000IU+链霉素5000IU/ml精液；金霉素0.6mg/ml精液。硫酸新霉素及青霉素+链霉素效果较好。此法简便、成本低廉，适合在生产上推广应用。
三、冷冻保存
常温保存和冷藏保存用于短期保存精液，而冷冻或超低温冷冻则可以长期保存精液。常用的制冷剂有干冰和液氮等。超低温下，精子的代谢停滞，精子处于假死状态，生命以静止形式保存。精子冷冻保存的基本技术路线为：精液的采集→加入稀释液和抗冻剂→降温平衡→液氮中长期保存→解冻复苏→活力检测。
1．稀释液、抗冻剂
稀释液的配制是鱼类精液冷冻保存中关键的一步。由于鱼的种的特异性，不同鱼类精液冷冻保存对稀释液的要求不同，目前还没有统一的标准。一般认为稀释液的成分在合适的范围内越简单越好。已用过的鱼类精液保存稀释液成份主要有：盐类(如NaHCO3、NaCl、KCl等)、糖类(如葡萄糖、果糖、蔗糖等)、脂类(主要是磷脂)和蛋白质(如卵黄、牛奶、小牛血清等)以及其他添加剂(如维生素、抗生素等)。有研究认为，海水鱼类用由葡萄糖和柠檬酸钠组成的稀释液就能获得良好的冷冻效果。淡水鱼类稀释液则应以氯化钠和氯化钾为主，加入少量氯化钙、氯化镁、碳酸氢钠和葡萄糖。常用的抗冻剂有甘油、二甲亚砜、乙二醇、乙酰胺和丙二醇等。甘油是海水鱼类精液冷冻保存的有效抗冻剂，而二甲亚砜广泛应用于淡水鱼类精液的保存。
2．冷冻方法
冷冻方法目前主要使用4种方法：颗粒冷冻法：麦管冷冻法；玻璃安瓿瓶冷冻法；塑料离心管冷冻法。颗粒冷冻法由于冷冻量小、操作较麻烦等原因，目前较少采用。玻璃安瓿瓶法虽然体积较大，效果也不错，但瓶口封口操作比较麻烦，加之在解冻时，安瓿瓶容易爆裂，故其使用也受到限制。而麦管冷冻法和塑料离心管冷冻法，由于具有冷冻量大、操作简便、安全等特点，广泛应用于鱼类精液冷冻保存和精子库建立。
3．降温平衡
降温平衡是否需要应鱼类的种类而异。对于某一种具体的鱼类精子而言，存在着其特异性的最佳冷却速率，过快或过慢的冷却速率均会导致细胞损伤，降低精子的存活率。目前常采用-10℃/min的下降速率，在到达某一低温后(-76℃，-150℃等)或直接浸入液氮中，或平衡一段时间后再浸入液氮中。
4．解冻复苏
解冻复苏是精子升温溶解复苏的过程。解冻的关键因素是解冻液和解冻速度。淡水鱼类冻精解冻液用体积分数0.65%~0.7%氯化钠溶液，海水鱼类冻精直接用海水即可。解冻方法有室温自然解冻和快速解冻，比较常用的是在30℃~40℃的水浴中快速解冻。一般而言，如果冷却过程的速率较快，那么相应的复温速率也要快。
5．活力检测
解冻后立即在显微镜下检查精子活力：即视野中作直线前进运动的精子的百分比。在原地颤动或摆动或作微弱曲线运动的精子无受精能力。
在常温条件下，将鱼类精子处于等渗环境中，减少精子用来调节渗透压平衡的能量消耗而延长精子的寿命。在人工授精操作过程中，用生理盐水代替淡水，可提高受精率。
二、冷藏保存
冷藏保存是利用普通冰箱的冷藏室(0~4℃)保存鱼类精液，这种方法可保存精液达数天至数十天，如果在精液中加入合适的稀释液，同时将冷藏室的问题调低，保存时间更长。冷藏保存时精子有微弱的代谢需要消耗氧气，因此在保存时应保持一定的空气或氧气。精液冷藏保存时,抗生素是必不可少的。常用的抗生素有：青霉素，5000IU/ml精液；硫酸新霉素，1mg/ml精液；青霉素1000IU+链霉素5000IU/ml精液；金霉素0.6mg/ml精液。硫酸新霉素及青霉素+链霉素效果较好。此法简便、成本低廉，适合在生产上推广应用。
三、冷冻保存
常温保存和冷藏保存用于短期保存精液，而冷冻或超低温冷冻则可以长期保存精液。常用的制冷剂有干冰和液氮等。超低温下，精子的代谢停滞，精子处于假死状态，生命以静止形式保存。精子冷冻保存的基本技术路线为：精液的采集→加入稀释液和抗冻剂→降温平衡→液氮中长期保存→解冻复苏→活力检测。
1．稀释液、抗冻剂
稀释液的配制是鱼类精液冷冻保存中关键的一步。由于鱼的种的特异性，不同鱼类精液冷冻保存对稀释液的要求不同，目前还没有统一的标准。一般认为稀释液的成分在合适的范围内越简单越好。已用过的鱼类精液保存稀释液成份主要有：盐类(如NaHCO3、NaCl、KCl等)、糖类(如葡萄糖、果糖、蔗糖等)、脂类(主要是磷脂)和蛋白质(如卵黄、牛奶、小牛血清等)以及其他添加剂(如维生素、抗生素等)。有研究认为，海水鱼类用由葡萄糖和柠檬酸钠组成的稀释液就能获得良好的冷冻效果。淡水鱼类稀释液则应以氯化钠和氯化钾为主，加入少量氯化钙、氯化镁、碳酸氢钠和葡萄糖。常用的抗冻剂有甘油、二甲亚砜、乙二醇、乙酰胺和丙二醇等。甘油是海水鱼类精液冷冻保存的有效抗冻剂，而二甲亚砜广泛应用于淡水鱼类精液的保存。
2．冷冻方法
冷冻方法目前主要使用4种方法：颗粒冷冻法：麦管冷冻法；玻璃安瓿瓶冷冻法；塑料离心管冷冻法。颗粒冷冻法由于冷冻量小、操作较麻烦等原因，目前较少采用。玻璃安瓿瓶法虽然体积较大，效果也不错，但瓶口封口操作比较麻烦，加之在解冻时，安瓿瓶容易爆裂，故其使用也受到限制。而麦管冷冻法和塑料离心管冷冻法，由于具有冷冻量大、操作简便、安全等特点，广泛应用于鱼类精液冷冻保存和精子库建立。
3．降温平衡
降温平衡是否需要应鱼类的种类而异。对于某一种具体的鱼类精子而言，存在着其特异性的最佳冷却速率，过快或过慢的冷却速率均会导致细胞损伤，降低精子的存活率。目前常采用-10℃/min的下降速率，在到达某一低温后(-76℃，-150℃等)或直接浸入液氮中，或平衡一段时间后再浸入液氮中。
4．解冻复苏
解冻复苏是精子升温溶解复苏的过程。解冻的关键因素是解冻液和解冻速度。淡水鱼类冻精解冻液用体积分数0.65%~0.7%氯化钠溶液，海水鱼类冻精直接用海水即可。解冻方法有室温自然解冻和快速解冻，比较常用的是在30℃~40℃的水浴中快速解冻。一般而言，如果冷却过程的速率较快，那么相应的复温速率也要快。
5．活力检测
解冻后立即在显微镜下检查精子活力：即视野中作直线前进运动的精子的百分比。在原地颤动或摆动或作微弱曲线运动的精子无受精能力。
随着鱼类养殖业的迅速发展以及杂交育种、优良品种的选育与提纯复壮等工作的开展，鱼类精液保存技术的应用越来越广泛。精液保存的鱼类种类由较为单一的品种扩大到各常见的海淡水鱼类以及一些濒危、珍惜水生动物，保存方法也由较为简单的常温保存、冷藏保存向更为复杂的冷冻保存逐渐深入。鱼类精子保存技术已经日趋完善，己分别建立了鲤科鱼类、鲑科鱼类、斑马鱼、罗非鱼、鲷科鱼类及鲻鱼等淡、海水鱼类精子冷冻保存技术，并建立了淡水鲤科鱼类和一些海水经济鱼类冷冻精子库。但还存在许多有待解决的问题，如冷冻条件的优化（稀释液的配方、降温速率、冷冻保存方法和解冻温度等），冷冻损伤造成精子死亡或活力降低，抗冻剂的洗脱等。
(通威 韩永望 )
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