鱼类转基因技术研究进展

发表时间:2024/05/15 10:53:50  来源:江西水产科技 2018年6期  浏览次数:198  
西南渔业网-丰祥渔业网秉承:求是务实不误导不夸大不炒作!水产专业网站为您提供优质服务!【郑重提醒】:本站所有文章,如需转载请注明出处,否则谢绝转载!!谢谢合~
市场在变,我们的诚信永远不会变!

鱼类转基因技术研究进展

董安然 成智丽 张彤 王宏宇 柏彬彬

(大连海洋大学水产与生命学院;辽宁省水生生物重点实验室,辽宁大连 116023)

鱼类是人类重要的蛋白质来源之一,且具有怀卵量大、体外发育,易于观察等特点。因此,鱼类不但是重要的经济动物也是研究中常用的模式动物。转基因技术有效打破了动物细胞接纳外源基因的进化壁垒,能将人为筛选改造过的基因遗传给下一代。相比于传统育种,为培育和改良优质高产、抗逆性强的鱼类新品系提供了更高效的途径。1985年,朱作言等研制出世界首例转基因鱼并建立了第一个转基因鱼模型,随后英国、法国、美国等几十个实验室开始了转基因鱼的研究[1]。近几年,美国批准了转基因大西洋鲑(Salmosalar)上市,成为全球第一例准入市场的转基因动物食品[2]。极大促进了培育安全可靠转基因鱼新品种的步伐。

1 鱼类转基因技术的主要原理及方法

1.1 鱼类转基因技术的主要原理

鱼类转基因是通过转基因技术,人工操作把外源目的基因导入性细胞系,使外源目的基因整合到动物本身的基因组中,从而外源目的基因随胚胎发育赋予受体动物新的生物学性状并稳定遗传给后代。如果外源目的基因整合到动物的部分细胞的基因组中,叫作嵌合体动物;而动物所有的细胞均整合外源目的基因,并具有将外源基因遗传给下一代的能力,叫作转基因动物。可以说,鱼类转基因技术是分子生物学、细胞学、遗传学、胚胎学、发育生物学等学科的综合应用[3]。

不论是原核显微注射法等物理手段,或者DEAE-葡聚糖法等化学手段,还是逆转录病毒介导的生物手段,其目的是将外源目的基因导入性细胞系,重点在于外源目的基因的整合与表达效率。通过对生物基因与表现型进行分析,从而了解外源目的基因的功能。

1.2 修饰外源目的基因常用方法

1.2.1 锌指核酸酶技术

ZFN ( zinc finger endonuclease ),锌指核酸酶是第一代人工核酸内切酶。锌指核酸酶包括DNA切割结构域FokI和锌指结构的DNA识别结构域两部分。FokI内切酶只有形成二聚体才有活性,DNA识别域包含3个或更多的Cys2-His2锌指蛋白。这些锌指蛋白每个可与3个连续的碱基对相互作用。ZFN技术开启了基因组靶向修饰技术的大门,与同源重组相比大大提高了基因编辑效率,其缺点在于细胞毒性和脱靶现象,且成本相对昂贵,所以被TALEN取代。

1.2.2 类转录激活因子效应物核酸酶技术

TALEN( transcription activator-like effector nuclease),类转录激活因子效应物核酸酶是第二代人工核酸内切酶,包括人工改造的核酸内切酶切割域FokI以及DNA识别域。DNA的识别区域包含许多重复保守的氨基酸序列模块组,其中每34个氨基酸组成一个模块,第12位、第13位氨基酸种类可变,决定了模块识别靶向点的特异性。TALEN与ZFN相似的是都是由一个结合域、DNA序列识别区以及一个DNA切割域构成的,不同的是TALEN的两个单体尾对尾对靶DNA进行特异性识别、结合,具有切割活性的非特异性二聚体FokI实现识别和切割。相比于ZFN,TALEN具有使基因操作简便、低毒性、低脱靶率等优点。但制约TALEN应用推广的因素在于其模块组装费时费力。

1.2.3 CRISPR/CAS核酸酶技术

CRISPR/CAS 9系统,成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白是第三代人工内切酶技术,CRISPR系统有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型三种类型,CRISPR/CAS 9是由结构较为简单的Ⅱ型系统为基础衍生而来。其原理简述为crRNA-tracrRNA形成RNA双链导向RNA分子(sgRNA),sgRNA与CAS 9蛋白结合,进而实现对靶DNA的编辑。其较前两代的优势在于成本低、制作简单、效率高、适用性广。

基因编辑技术在转基因鱼类的研究中,主要应用在基因敲除、基因定点整合和基因转录调控三方面。对于培育新品系,实现多基因调控性状的改良,基因编辑技术具有广阔的前景和重要意义。近年来,利用基因编辑技术在斑马鱼的研究中,进行基因敲除实验和转基因实验。日本学者(2014年)运用CRISPR/CAS 9技术,对evx2 基因位点和eng1b 基因位点进行修饰,用显微注射法注射到斑马鱼性细胞系中,成功将外源目的基因整合并表达;刘斐斐(2017年)等利用CRISPR/CAS 9技术有效将外源目的基因整合到斑马鱼基因组的特定位置,通过显微注射法将eGFP荧光蛋白导入斑马鱼性细胞系中,获得了51.72%的转基因斑马鱼。

1.3 鱼类转基因技术的常用方法

1.3.1 显微注射法

显微注射法是借助显微镜的放大技术,直接将外源目的基因注射到鱼类卵母细胞、受精卵、早期胚胎、胚胎干细胞活体细胞中,然后生产个体的方法。此方法是制备转基因生物最简单可靠的方法,其应用范围广,转基因长度可达数百kb,即尽量在合子(受精卵)形成早期导入转基因的DNA,当精子和卵细胞结合,DNA就被直接注射入细胞中,不需要载体。因此,不存在扰乱该过程的外源基因序列。其缺点在于导入的基因随机整合在染色体DNA上,有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或点突变。显微注射法应用依赖于鱼类卵母细胞体外成熟技术,至今报道的卵母细胞能在体外条件下完全成熟的只有金鱼、斑马鱼和青鳉3种[3]。在斑马鱼、大西洋鲑鱼、鲤鱼、美国鲇鱼、泥鳅鱼、鲫鱼等转基因研究中广泛采用此方法。1986年,Ozato等用显微注射法将外源目的基因SV40PcCr导入青鳉鱼体内成功获得了转基因鱼[4]。

1.3.2 电穿孔法

电穿孔法是利用脉冲电场提高细胞膜的通透性,在细胞膜上形成纳米大小微孔,使外源目的基因转移到细胞中。此方法可大批处理受精卵且操作简便,但外源基因导入随机且转移频率相对较低[3]。1992年,Buono等用此技术成功使乙酰转移酶基因在斑马鱼体内表达[5]。

1.3.3 精子载体介导法

该方法是将精子作为外源目的基因运载工具,用人工授精的方法导入卵内的技术。其优点是准确性极高,且省略了显微注射等方法的复杂过程和设备;缺点在于难以高效地将外源目的基因导入精子细胞中。目前,根据外源目的基因的导入形式等,又可分为直接混合法、电穿孔精子载体法、脂质体法三种。1989年,沈孝宙用鲤精子作为运载工具,成功获得超过50%明显表达生长素的转基因鱼[6]。

1.3.4 基因枪法(微弹轰入法)

基因枪法是用吸附DNA的钨微粒子高速轰击受体细胞,从而达到转移外源目的基因的目的。此方法在植物转基因领域应用较多。其优点在于可在短期内处理多个细胞。但由于其稳定性和表达的问题,以及鱼类的卵核小而卵黄大的特点,导致该方法应用较少[3]。1990年,Zelenin等用基因枪法将含有半乳糖酶和新霉素磷酸转移酶的目的基因序列成功转移到虹鳟、欧洲泥鳅和斑马鱼的胚胎中[7]。

此外,动物转基因技术还有染色体片段微注入法、逆转录病毒介导法、胚胎干细胞介导法、磷酸钙共沉淀法、激光处理法、DEAE-葡聚糖法等。但在鱼类转基因研究中,还没有较为成功的报道。

2 鱼类转基因技术的研究方向

2.1 抗病育种

转基因动物研究中,抗病育种一直作为一个研究热点,在鱼类转基因的研究中对比畜牧转基因抗病育种工作,开展的工作相对晚一些。2004年,Mao等使用电穿孔法将hLF基因的cDNA转入草鱼的性细胞系中,获得了超过55%的对嗜水气单胞菌抗性显著提高的转基因草鱼;2005年,EL-Zaeem and Assem将鲨鱼的DNA注射到了罗非鱼性细胞系中,获得了具有抗体活性高、免疫球蛋白大量提高的转基因鱼类。

2.2 性状改良

鱼类的品种改良涉及到鱼的生长速度、适应性、营养组成和抗逆性等。对比传统育种通过转基因技术对鱼类进行品种改良可以极大缩短改良进程。在最早的转基因鱼类的研究中,首先是导入生长激素基因(GH)加快生长速度,提高经济效益。2000年,Martinez等成功从鲑鱼提取生长激素,导入了罗非鱼性细胞系中,在CMV启动子驱动下,成功培育出食物转化率显著提高2.9倍的转基因鱼。在品种改良中,抗冻蛋白的转基因鱼类培育也是转基因的热点,但此前的转抗冻蛋白基因鱼类都未达到预期效果。2005年,Dunham等将转抗冻蛋白的斑点叉尾鮰置入土池,存活率对比非转基因斑点叉尾鮰约提高40%。通过转基因技术对鱼类进行品种改良育种,将是未来的重要研究方向。

2.3 模式生物

鱼类具有个体适中,世代周期短、胚胎透明、体外发育等特点,斑马鱼是鱼类中较有代表性的种类。因此,转基因鱼类作为模式生物对于基因的表达调控、形态发生发育、环境监测药物筛选等领域具有独特优势。2009年,夏铭等成功用转基因斑马鱼构建了胰岛素β-细胞发育模型;2013年,蒲韵竹等用转基因斑马鱼建立了阿尔茨海默病动物模型[10]。随着多种鱼类基因组测序工作的完成,我们看到了鱼类作为模式生物的广阔前景,为人类在疾病治疗、疾病机理、药物研发等领域提供了更多科学依据。

3 鱼类转基因技术的发展趋势

3.1 转基因技术与多种生物技术结合发展

近几年,转基因鱼类的研究主要集中在提高生长速度、抗逆抗病育种等与经济效益有关的研究工作,但随着分子生物学、生物信息学等相关领域的不断突破,鱼类转基因研究将越来越呈现多学科交叉的特点。最近,我国我国完成了大量鱼类的基因组测序和功能基因注释工作,包括鲤鱼、草鱼、大黄鱼等,将已知鱼类的优良性状通过转基因平台,可以广泛的开展转基因鱼类的育种工作。基因编辑技术的发展不仅显著提高了转基因效率,还在外源目的基因的定点整合中,对转基因鱼类的研究起到了不可替代的作用。未来的鱼类转基因,将会越来越依靠分子生物学、细胞学、遗传学、胚胎学、发育生物学等学科等学科的理论技术突破,完成自身的创新发展。

3.2 重要功能基因来源多样化

随着基因组、蛋白组等“组学”的发展,以及基因组测序、高通量基因筛选、基因组关联分析等技术的大规模应用,外源目的基因的来源呈现多样化趋势,可以从微生物、动物、植物等挖掘出抗旱、抗寒、抗虫、营养改良等功能丰富的基因。鱼类作为脊椎动物门中占半数以上的种类,其繁殖周期和繁殖数量的优势明显,将会成为功能基因的“重要产地”和性状输出生物,为转基因育种研究注入新的动力。

3.3 多基因复合性状转基因鱼的研发

转基因鱼类在研发初期主要集中在单一功能的外源目的基因上。随着生物技术的不断进步,多基因复合性状的转基因技术将成为研发重点。多基因不仅能够使性状协同表达,还会大大提高基因转化率。未来转基因鱼将具有肉质好、生长快、耐低温低氧等许多复合优良性状。

3.4 转基因鱼类作为生物反应器的研发

生物反应器是指通过转基因生物对外源目的基因的高效率表达,进而工业化生产功能蛋白质的技术。现在,世界许多公司利用转基因生物反应器生产医用蛋白,例如β-乳球蛋白、hFVIII和红细胞生成素等。但以转基因鱼类作为生物反应器的研究还相对滞后,鱼类作为高产量、低成本的生物反应器优势明显。随着鱼类转基因技术的日趋成熟,鱼类作为生物反应器必将迎来属于自己的时代。

声明:转载文是出于传递更多信息之目的。若有标注错误或侵犯了您的合法权益,请与本网联系,我们将及时更正、删除,谢谢
“养鱼第一线”微信公众订阅号头条@渔人刘文俊

"养鱼第一线"微信公众帐号和头条号将会定期向你推送本号信息将为你精诚服务!

查看评论[0]文章评论