苯甲酸雌二醇对新吉富罗非鱼雌性化的影响

王茂元，黄洪贵，钟全福，田 田，吴妹英

(福建省淡水水产研究所，福建 福州 350002)

鱼类生长普遍存在着雌雄个体差异现象，有的表现为雄性生长速度快，成年个体大于雌性，例如罗非鱼(Oreochromisspp.)、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)、乌鳢(Channaargus)等；有的表现为雌性生长速度快，成年个体大于雄性，例如鲤(Cyprinuscarpio)、泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)、半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)等。因此，控制鱼类性别和加快单性别养殖对其产业发展具有重要意义。

罗非鱼因具有适应性强、生长快、肉质鲜嫩等优点，已经成为被全世界广泛养殖的鱼类之一，在淡水养殖中占有重要地位，是我国南方地区重要的出口创汇品种。由于雄性罗非鱼生长速度快于雌性，因此，开发单雄性罗非鱼一直是罗非鱼养殖业十分关注的焦点。目前，罗非鱼雄性化苗种生产中用到的方法主要有人工挑选、种间杂交、雄性诱导和三系配套技术，其中三系配套技术中，假雌性鱼的获得最为关键，常用的方法是通过外源雌激素进行人工诱导。而有关使用雌激素诱导罗非鱼雌化的研究已有相关报道，但使用的激素、方法以及试验鱼各不相同。在二十世纪八九十年代，国内一些专家[1-3]就用口服苯甲酸雌二醇(Estradiol benzoate，EB)的方法成功诱导了莫桑比克罗非鱼(Oreochromismossambicus)雌性化；也有一些学者通过使用乙烯雌酚(Diethylstilbesterole，DES)[4-5]、乙炔基雌二醇(Ethinylestradiol，EE2)[6]、雌酮(Estrone，E1)[7]投喂尼罗罗非鱼(O.niloticu)的方法诱导其雌性化。

由于DES等具有很强的毒性，已被禁止在生产中使用[3-4]，而雌二醇是鱼类内源性激素[8]，对硬骨鱼类性别决定与分化起重要作用。在美国、日本、以色列等国家，关于利用类固醇激素控制罗非鱼性别[9]的研究已经广泛存在，且比较成熟。虽然我国将苯甲酸雌二醇列为食品动物禁用兽药，但规定是指以促生长为目的的使用受到禁止，而在制种的过程中并未禁止。因此，本研究以苯甲酸雌二醇作为诱导激素，设定不同诱导浓度和时间梯度，通过口服、浸浴方法研究其对新吉富罗非鱼雌性化的影响，为将来利用三系配套技术进行全雄性罗非鱼制种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验鱼种取自由同一对亲鱼生产的卵黄囊刚吸收完的第0天新吉富罗非鱼苗，该亲鱼从上海海洋大学水产动物种质试验站引进。苯甲酸雌二醇(EB)为分析纯，购自湖北远城药业有限公司。

1.2 受精卵的获取与孵化

选择繁育用雌、雄新吉富罗非鱼亲鱼，在2.0 m×1.0 m×1.5 m的网箱中进行配对繁殖，雌雄配比为1∶2。配对完成后15 d左右，每日检查雌鱼口中是否有受精卵，一旦观察到受精卵，立即从其口中取出，放置在0.45 m×0.35 m×0.30 m孵化缸中进行孵化，水温(25.0±0.5)℃。

1.3 含有EB饲料的配制

试验前将EB溶于95%酒精中，待充分溶解后，使用喷壶均匀地喷洒在鳗鱼配合饲料上，混合均匀后，在室温下晾晒，待酒精挥发后，装袋冷藏备用。

1.4 雌性化诱导试验

1.4.1 口服含有EB饲料的雌性化诱导

随机取出刚孵化的新吉富罗非鱼苗3 000尾，分成3组。Ⅰ组饱食投喂50 mg/kg EB的激素饲料，30 d后取180尾平均分成3组，投喂不含激素的正常饲料；剩余的鱼苗继续投喂含有激素的饲料，60 d后取180尾平均分成3组，投喂不含激素的正常饲料；剩余的鱼苗继续投喂含有激素的饲料，90 d后取180尾平均分成3组，投喂不含激素的正常饲料。Ⅱ组和Ⅲ组分别投喂100 mg/kg EB、150 mg/kg EB的激素饲料，方法同Ⅰ组。对照组全程投喂不含EB的人工配合饲料。试验在100 m2水泥池网箱中进行，网箱规格为2.0 m×1.0 m×1.0 m，试验期间水温范围在25～29℃之间。

1.4.2 浸浴含有EB的雌性化诱导

取刚孵化的新吉富罗非鱼苗分别放进含有50、100、150 μg/L EB的养殖水体中浸浴培育，每种浸浴浓度设置3个平行，每个平行60尾鱼苗，同时设置对照组。浸浴培养时间为30 d，随后转入正常方式培养。

1.5 性别鉴定

性别判定采用观察生殖孔和性腺染色镜检[10]双重判定标准，雌鱼腹部后下方、臀鳍前方有3个孔，分别为肛门、生殖孔和泌尿孔，而雄鱼只有肛门和泌尿孔。泌尿孔在生殖突的顶端，生殖孔位于肛门和泌尿孔之间，为一字形的狭长开口，与生殖突垂直。为保证本实验的可靠性，当鱼生长至15 cm时再进行性别鉴定。性腺染色判定标准见图1。

注：A.10×10倍镜下雌性罗非鱼性腺压片图；a.卵原细胞；B.10×10倍镜下雄性罗非鱼性腺压片图；b.精原细胞。

1.6 数据处理与分析

利用Excel 2007和SPSS 17.0软件进行统计处理与检验分析，用平均数±标准差(M±SD)表示，显著性水平设置为α=0.05。用单因子方差分析(One-way ANOVA)比较雌性率和成活率的差异。

2 结果与分析

2.1 口服含有EB饲料的雌性化诱导效果

从表1可以看出，口服EB饲料的浓度和投喂时间均对新吉富罗非鱼雌性化诱导存在不同程度的影响。从雌性率来看，无论从处理浓度还是处理时长，3个试验处理组与对照组均存在极显著差异(P<0.01)，且均高于对照组，其中150 mg/kg饲料处理组投喂90 d的雌性率最高为94.45%，比对照组的46.11%高49.34%，50 mg/kg饲料处理组投喂30 d的雌性率最低为65.00%，但与对照组相比仍高出17.22%；各个处理组间，口服50 mg/kg饲料处理组的雌性率随着投喂时间延长而增高，投喂60 d和90 d的雌性率均与投喂30 d的雌性率差异极显著(P<0.01)，但60 d和90 d的雌性率之间无明显差异(P>0.05)；同样，口服100 mg/kg和150 mg/kg饲料处理组的雌性率发展趋势与50 mg/kg饲料处理组基本一致，但雌性率均高于50 mg/kg饲料处理组，且存在极显著差异(P<0.01)。

另外，从成活率方面来看，口服含有EB饲料的试验处理组与对照组均未有显著差异(P>0.05)，且未发现畸形鱼，表明口服苯甲酸雌二醇未对罗非鱼造成畸形伤害。

表1 不同药物浓度对新吉富罗非鱼雌性化诱导结果比较

2.2 浸浴含有EB的雌性化诱导效果

从表2可以看出，浸浴在含有EB的水体中培养新吉富罗非鱼30 d，不同药物浓度对雌性化诱导存在不同程度的差异。三个浸浴梯度的雌性率随着浸浴浓度的升高，雌性率逐渐升高，且均极显著高于对照组(P<0.01)；处理组中，使用50 μg/L浸浴浓度雌性率为63.33%，显著低于100 μg/L和150 μg/L的雌性率；但100 μg/L和150 μg/L之间，雌性率无显著差异(P>0.05)。各处理组与对照之间罗非鱼的成活率未有显著差异(P>0.05)，且未见畸形鱼，表明浸浴苯甲酸雌二醇未对罗非鱼造成畸形伤害。

表 2 不同浸浴浓度对新吉富罗非鱼雌性化诱导结果比较

2.3 投喂与浸浴含有EB的雌性化诱导效果比较

从表3可以看出，在30 d的雌性诱导过程中，投喂与浸浴含有EB对新吉富罗非鱼雌性化诱导的效果不一致。通过投喂含有EB饲料的方法与浸浴含有EB的方法进行雌性化诱导，结果显示，在相同诱导时间和诱导剂量条件下，口服方法的雌性化率均高于浸浴方法。三个诱导梯度中，口服100 mg/kg EB的雌性率显著高于浸浴100 μg/L的雌性化率(P<0.01)，而其余两个梯度之间雌性化率差异不显著(P>0.05)。

表 3 口服与浸浴对新吉富罗非鱼雌性化诱导结果比较

3 讨论

在鱼类的性别决定与分化中起关键作用的是遗传物质，但其也受到环境因素的影响。特别是外源激素可以起到性逆转的作用，Yamamoto最先报道了通过外源雌激素或雄激素处理青鳉(Oryziaslatipes)导致性逆转[11]，后来其他学者也在鱼类性逆转的研究中发现，在性腺性分化的关键时期，通过使用外源激素在处理受精卵、仔鱼、稚鱼，可以导致雄鱼的雌性化或雌鱼的雄性化[12-14]。激素诱导鱼类性逆转常用的方法主要有投喂、浸浴和注射，其中使用较多的是口服投喂。目前在关于使用外源激素控制罗非鱼性别转化的研究中，关注较多的是如何向雄性化性逆转[15-16]，而罗非鱼雌性化的性逆转研究不多，且使用的外源雌激素种类、方法、浓度以及试验鱼种各不相同，效果也不一样，如Jensen等分别使用剂量为30 mg/kg、60 mg/kg、120 mg/kg的雌三醇、雌酮以及雌二醇诱导奥利亚罗非鱼(Oreochromiscoaureus)21 d和35 d，雌化无效果[17]；Hopkins使用剂量为20～100 mg/kg的己烯雌酚诱导奥利亚罗非鱼35 d和56 d，雌性率仅为64%[18]；杨永铨等使用剂量为50～80 mg/kg的雌激素分别诱导奥利亚罗非鱼30 d、60 d和100 d，雌性化效果均不明显[19]；Liu采用雌酮对奥利亚罗非鱼苗进行雌性化，实验效果不显著[20]；Melard使用乙炔基雌二醇进行奥利亚罗非鱼雌性化实验，获得少量转化雌鱼[21]；Melchor等分别使用剂量为25～10 mg/kg、100～200 mg/kg的已烯雌酚和雌酮诱导尼罗罗非鱼25 d、35 d和59 d，雌性率为62%～90%[22]；Nakamura等使用剂量为50 mg/kg的乙炔基雌二醇诱导莫桑比克罗非鱼20 d，雌性率为100%[23]。本研究中，口服含有EB饲料的雌性化诱导，新吉富罗非鱼的雌性率随着浓度的增加、处理时间的延长而升高，其中雌性率最高为150 mg/kg饲料处理组(94.45%)，这与万松良等[24]使用100 mg/kg EB饲料持续诱导59 d的罗非鱼雌性率为94%的效果一样，表明口服含有一定剂量EB饲料诱导新吉富罗非鱼性反逆，具有较好的雌性化效果。

另外，本研究中，还通过设置养殖水体中含有50 μg/L、100 μg/L和150 μg/L EB浓度，浸浴30 d诱导新吉富罗非鱼性逆转，结果显示新吉富罗非鱼的雌性率随着浓度的增加而升高，其中以100 μg/L和150 μg/L诱导效果较好，雌性率分别为68.89%和77.78%，相反，Eekstein等使用50～1 000 μg/L浓度的己烯雌酚浸浴奥利亚罗非鱼35～42 d，由于死亡率和畸形率高，未获得雌性化鱼[25]，这可能是由于本实验所使用的雌激素种类和受试试验鱼种类不同造成的。根据我国《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》(农业部发公告第193号)规定，苯甲酸雌二醇被列为“不准以抗应激、提高饲料报酬、促进动物生长为目的在食品动物饲养过程中使用”范围内，而未规定在制种过程中不得使用。而且关于利用类固醇激素控制罗非鱼性别的研究在国外已经广泛存在，且比较成熟，进入动物体内绝大部分随着排泄物代谢至体外[9]。

综上所述，本研究以新吉富罗非鱼作为试验鱼种，以苯甲酸雌二醇作为外源性雌激素，通过对比雌性化诱导效果，表明口服和浸浴两种雌性化方法诱导新吉富罗非鱼性逆转均具有良好的效果，但综合考虑实效性和方便性，建议以后利用三系配套技术进行雄性罗非鱼制种，采用口服的方法更容易诱导和获得雌性化鱼。