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蜂房芽孢杆菌B-91几丁质酶的合成条件

郑志成 周美英 姚炳新

摘要：从厦门地区牡蛎养殖场分离筛选到一株产几丁质酶活力较高的蜂房芽孢杆菌(Bacil -lus alvei)B-91 , 研究了该菌几丁质酶的合成条件。结果表明：该菌在以几丁质为碳氮源的培养基中生长，能合成多量的几丁质酶。酶的合成受各种几丁质诱导。在产酶培养基中添加不同的有机或无机氮源，均能促进酶的合成，而葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖对酶合成有阻遏作用。该菌几丁质酶合成的最适培养基初始pH为6.8，最适温度为28.C。在250ml三角瓶装50ml培养基，接种量为2%，振荡培养60h时，培养液中几丁质酶活力可达2212u/mL。

关键词：蜂房芽孢杆菌，几丁质酶，合成条件

几丁质是自然界中除纤维素外贮量最大的生物多聚糖。几丁质酶( Chitihanse，EC3.4.1.14)可催化水解几丁质的β-1.4糖苷键生成N-乙酞氨基葡萄糖(N-acetylglcosamine，NAG)，因此在蟹、虾壳等几丁质废物的转化和利用方面有重要作用。国外对微生物几丁质酶进行了许多研究，包括产生几丁质酶的微生物、酶的特性及酶的分子生物学等。近年来对几丁质酶采用基因重组技术， 获得了具有抗真菌、线虫、昆虫和其它病原体的转基因植物，但迄今未见有关蜂房芽孢杆菌几丁质酶合成条件的研究报道。为了开发利用几丁质酶，我们从分离到100余株产几丁质酶细菌中，选出一株几丁质酶活力较高的蜂房芽孢杆菌B-91，研究该菌株几丁质酶的合成条件。本文报道这研究结果。

1 材料与方法

菌株：B-91菌株为本实验室从厦门地区牡蛎养殖场滩涂分离筛选得到，经分类鉴定该菌株为芽孢杆菌属的蜂房芽孢杆菌(Bacillus alvei)。

培养基:

l)斜面培养基(%)：牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，葡萄糖0.5，K2Hpo4(西南渔业网注：磷酸氢二钾)0.1，Na2HPO4(西南渔业网注：磷酸氢二钠)0.2，MgSO4•7H2O(西南渔业网注：七水硫酸镁)0.05，NaCI(西南渔业网注：氯化钠)0.5，KCI(西南渔业网注：钾盐)0.05，琼脂1.8，pH7.2；

2)种子培养基：除不加琼脂外，其它成分同斜面培养基；

3)基础培养基(%)：KH2po4(西南渔业网注：磷酸氢二钾)0.1，Na2HPO4(西南渔业网注：磷酸氢二钠)0.2，MgSO4•7H2O(西南渔业网注：七水硫酸镁)0.05，KCI(西南渔业网注：钾盐)0.05，pH6.8；

4)产酶培养基：在基础培养基中加人2.0%几丁质即为产酶培养基。

几丁质预处理：试验用几丁质(江苏农学院出品)、脱矿质几丁质和脱乙酰几丁质(由国家海洋局第三海洋研究所提供)均经研碎，过150目筛。胶体几丁质则是由几丁质经浓HCI处理，离心后上清液于蒸馏水中沉淀而成。蚕蛹壳粉和虾壳粉分别由蚕蛹壳和虾壳经洗净、干燥、磨碎过筛而成。上述几丁质均经单独灭菌，于接种时与培养基的其它成分混合。

培养条件：取经28.C培养48h的斜面菌种一环，接入种子培养基，于28.C旋转(2OOr/min)摇床振荡培养24h后，按2%接种量将种子液接入试验的培养基中，置同一摇床振荡培养。除另有说明外，产酶试验的培养温度均为28.C，培养时间为60h，培养基装量为25OmL三角瓶装50mL培养基。

酶活力测定：培养液经8000r/min离心10mln，上清液即为粗酶液。取此粗酶液1mL，加人到含5.0mg胶体几丁质的柠檬酸缓冲液(pH5.0)1ml中，40.C保温振荡1h，流水冷却，4000r/min离心10 mim，取上清液测定NAG(西南渔业网注：乙酰氨基葡萄糖苷酶)量，并以蒸馏水代替胶体几丁质，按上法测定作为空白对照，NAG量按Johnson的改良法测定，一个酶活力单位定义为在上述条件下产生1ugNAG的酶量。

生物量测定：取经20倍稀释的培养液，以未接种等倍稀释的培养基作为对照，在721分光光度计620nm处测定光吸收值。

2 结果与讨论

2.1氮源对酶合成的影响

以产酶培养基作对照，在该培养基(初始pH均为6.8)中添加不同氮源，振荡培养后分别测定培养液酶活力。结果(表1)表明，添加的10种有机和无机氮源均能促进酶的合成。有机氮源以酵母膏和酪蛋白的酶活力最高，分别比对照高96.2%和85.4%，其次为牛肉膏和玉米浆，而蛋白胨和黄豆粉对酶合成也有一定的促进作用。无机氮源以NH4NO3(西南渔业网注：硝酸铵)和(NH4)2SO4(西南渔业网注：硫酸铵)的酶活力最高，分别比对照高108.7和102.1%，而NH4CI(西南渔业网注：氯化铵)和NaNO3(西南渔业网注：硝酸钠)对酶的合成也有较好的促进作用。

2.2 碳源对酶合成的影响

在产酶培养基中添加浓度为2.0%的不同碳源，产酶试验结果(表2)表明，在添加的5种碳源中除淀粉提高了培养液的酶活力外，其它碳源均使酶活力显著下降，而以添加葡萄糖的培养液酶活力最低，说明这4种糖对该菌株几丁质酶合成有阻遏作用。这个结果与文献报道一致。

2.3 酶合成的诱导特性

以基础培养基作对照，在该培养基中分别加人不同的几丁质或含几丁质的物质作为酶合成诱导物，酶活力测定结果(表3)表明， 蜂房芽孢杆菌B-91在含有几个质作为唯一碳氮源培养基中才能合成几丁质酶，这与文献报道对Stre ptom yces，as-pergillus和Myrothecium的研究结果一致。但Neugebauer曾报道Stre ptom yces TK24产几丁质酶为几丁质所诱导，而在没有几丁质存在的培养基中也能产生少量的几丁质酶。这可能是由于使用的微生物菌种或菌株特性不同所致，在添加几丁质浓度为2.0%时，这些物质均能诱导合成较高活力的几丁质酶，其中以蚕蛹壳粉、几丁质和虾壳粉效果最佳, 而脱矿质几丁质、胶体几丁质和脱乙酰几丁质也有较好的诱导作用。说明该菌株几丁质酶是一种诱导酶。几丁质和含有几丁质的物质是该菌几丁质酶合成的良好诱导物，而几丁质单糖(NAG)则不能诱导该酶的合成。从蚕蛹壳粉和虾壳粉强烈诱导几丁质酶合成的发现，说明它们可作为几丁质酶生产的良好原料，这将为这些原料的开发利用提供了新的途径。采用不同浓度(1.0%一4.0%)几丁质诱导试验结果表明，添加几丁质的适宜浓度为2.0%高于这个浓度酶活力并没有提高。

2.4 培养时间对酶合成的影响

取经培养24h的种子液，按2%接种量接入产酶培养基，28.C振荡培养至96h，定时取样分别测定生物量和酶活力。结果(图1)表明，该菌在培养24h至48h处于对数生长期，与此同时几丁质酶活力也急速提高。当培养60-84h时，菌生长处于稳定期，酶活力达到最高值。随着培养时间的延长，芽抱大量形成，酶活力也出现下降趋势。这些结果说明该菌菌体生长与几丁质酶合成是基本同步的，产酶最适培养时间为60h。

2.5 培养基初始pH对酶合成的影响

将产酶培养基调至不同pH，进行产酶产酶试验。结果(图2)表明，当培养基初始pH为6.8时，该菌培养液几丁质酶活力达最高值，pH低于6.4或高于7.0时，酶活力降低。

2.6 培养温度对酶合成的影响

培养温度对酶合成影响的试验是在22-36.C的梯度摇床上培养60h，测定培养液酶活力(图2)。在26-30.C之间，酶活力都较高。培养温度以28.C为宜。

2.7 通气量对酶合成的影响

采用250mL三角瓶，分别加入30、40、50、60、70、80、90mL培养基，接种培养后，分别加水到原来的体积，测定酶活力。结果( 图2)表明，在250mL三角瓶中加人40-70mL培养基的酶活力均比较高，培养基装量超出此范围，酶活力有所降低，说明通气量对蜂房芽孢杆菌B-91几丁质酶合成影响小，这一特点对利用该菌进行几丁质酶生产是有利的。

参考文献

略

(本文来源：厦门大学学报(自然科学版)，1995年5月，第34卷第3期)

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