作者：李卓昱1，鲍玉杰1，尚玉曼1，袁增智1,2*

单位：1.天津师范大学生命科学学院；2.天津市动植物抗性重点实验室

简介：李卓昱，硕士研究生，研究方向：水生生物分子生物学。*通信作者，讲师，从事水产动物病害学研究。

基金项目：天津师范大学博士基金资助项目（52XB1412）。

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是我国北方重要的海水养殖鱼类，隶属鲽形目（Pleuronectiformes）舌鳎科（Cnoglossidae）舌鳎属（Cynoglossus），作为一种深受广大消费者欢迎的鱼种，具有较高的经济食用价值。近年来，各类疾病的出现使半滑舌鳎的健康状况和养殖事业受到极大威胁，其中以细菌性疾病居多。

为进一步阐明养殖半滑舌鳎体表溃疡病病原及发病机制，笔者开展了相关病原菌的筛选工作，并从患溃疡病的半滑舌鳎体表筛选出一株溶藻弧菌，编号为H1B6，从形态观察、生理生化鉴定、Biolog微生物鉴定、16S rDNA序列分析方面对分离菌株进行了鉴定，旨在探究其致病性，为今后半滑舌鳎溃疡病的防控与治疗提供一定的科学依据。

1

材料与方法

1.1

材料

培养基：TCBS和2216E琼脂。

试剂：2×TaqPCR Master Mix购自博迈德生物有限公司；生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司；Biolog GEN Ⅲ 鉴定板购自基因有限公司。

仪器：超净工作台（SW-CJ-1FD，江苏通净）、高压灭菌锅（SX-500，江阴滨江医疗有限公司）、pH计（METTER TOLEDO，北京六一仪器厂）、离心机（Centrifuge5415R Eppendorf）、PCR仪（BIO-RAD）、恒温培养箱（SPX-150B-D，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、数显恒温水浴锅（HH-3A型，金坛市金南仪器制造有限公司）、电泳仪（DYY-6C型，北京六一仪器厂）、全自动微生物鉴定系统（MicroStation Biolog）。

试验动物：患病的半滑舌鳎、攻毒用斑马鱼。

1.2

方法

取患溃疡的半滑舌鳎进行病原菌的分离，对分离得到的优势菌株进行16S rDNA检测、生理生化鉴定、Biolog微生物鉴定、斑马鱼攻毒试验。

2

结果与分析

2.1

病鱼临床症状

患体表溃疡病的半滑舌鳎发病前期体表出现大量白色溃疡点，活力减弱，摄食减少。随着病情的加重，溃疡面积逐渐增大，可引发大面积溃烂现象，甚至断尾，肠道肿大、鼓出，几乎脱出肛外（图1），严重时可致死。

图1 患溃疡病的半滑舌鳎

2.2

病原菌分离结果及形态特征

该试验筛选到一株优势菌株，编号H1B6，革兰氏染色结果呈阴性，呈短杆状（图2）。

图2 H1B6菌株的革兰氏染色结果

该菌株在2216E培养基上呈1~2mm圆形状，无色透明，有扩散趋势，有黏性，不易挑起。该菌株在绿色TCBS培养基上为黄色圆形菌落，表面光滑，富有黏性，见图3。

图3 TCBS培养基上H1B6菌株的菌落特征

2.3

16S rDNA序列分析及进化树分析

以细菌DNA为模板，对其进行16S rDNA基因的PCR扩增，发现条带单一，有一条1 500bp左右大小与预期相符的单一条带（图4）。将序列拼接片段在NCBI网站上进行BLAST比对，发现菌株16S rDNA基因为弧菌属，其中与副溶血性弧菌（序列号为KX860115.1）同源性高达100%，与溶藻弧菌（序列号为KT986175.1）同源性也高达100%，由此可初步判定H1B6致病菌为弧菌属。

注：M.DNA marker；1.16S rDNA

图4 H1B6菌株16S rDNA序列的PCR扩增结果

与找到的与其同源性较高的序列进行系统发育进化树分析（图5），结果显示H1B6菌株与溶藻弧菌聚为一支。

图5 H1B6菌株16S rDNA序列系统进化树分析

2.4

生理生化鉴定

生化鉴定结果（表1）表明，该菌株在3%NaCl中可正常生长，可将葡萄糖分解为丙酮酸，丙酮酸继续分解，产生甲酸、乳酸等，在M-R反应中呈阳性。对蔗糖、甘露醇、赖氨酸、鸟氨酸的利用呈阳性，不可利用乳糖、精氨酸和硫化氢，V-P反应呈阴性。将鉴定结果与《伯杰氏细菌鉴定手册》中弧菌属性状进行比较，可确定H1B6菌株与溶藻弧菌最为相似。

2.5

Biolog微生物鉴定结果

利用GENⅢ鉴定板对菌株H1B6的碳源利用及化学敏感性进行检测，鉴定结果如图6所示。菌株H1B3呈阳性反应的有24个，呈阴性反应的有42个，呈边界值反应的有30个。碳源利用检测呈阳性反应的有11个，呈阴性反应的有36个。化学敏感性检测呈阳性反应的有13个，呈阴性反应的有6个。根据2个重要的鉴定参数SIM（相似性）及DIST（距离）可知，当SIM越接近于1，则相似性越高；若DIST小于5，即可确定其菌株分类。

图6 菌株H1B6在GENⅢ鉴定板上的鉴定结果

Biolog鉴定结果如表2所示，H1B6菌株为溶藻弧菌的PROB（可能性值）为0.986，SIM和DIST值均在可接受范围内，因此确定H1B6菌株为溶藻弧菌。

2.6

斑马鱼毒力试验结果

毒力试验结果如表3所示，腹腔注射6h开始，Ⅲ、Ⅳ组斑马鱼表现出明显的食欲不振、活力下降、失去方向感，并开始死亡。

观察死鱼发现其体表充血，鱼体泛白，黏液增多，腹部肿胀，尾部呈上翘状，具有典型的急性细菌侵染败血症病理变化特征，如图7所示。Ⅳ组12h死亡率达100%，Ⅲ组24h内全部死亡，Ⅱ组累计死亡率仅为20%，此后再无死亡现象，Ⅰ组和空白对照（CK）组无死亡现象。使用SPSS 16.0统计软件建立线性回归方程y=107x－414286（R2=0.9884），由该公式计算出H1B6菌株的24h LD50值为4.58×106CFU/mL。

注：A.感染斑马鱼；B.健康的斑马鱼

图7 感染溶藻弧菌斑马鱼的临床症状

3

讨 论

从患病的半滑舌鳎溃疡体表处筛选到一株H1B6优势菌株，根据形态观察、16S rDNA检测、生理生化鉴定结果，H1B6菌株与溶藻弧菌最为接近，而在以16S rDNA序列构建的系统发育进化树模型中，H1B6菌株也与溶藻弧菌菌株聚为一支。Biolog微生物鉴定结果显示，H1B6菌株为溶藻弧菌的可能性为98.6%，确定H1B6菌株为溶藻弧菌。斑马鱼攻毒试验结果显示，H1B6菌株24h的半数致死浓度（LD50）为4.58×106CFU/mL。

该研究中也将斑马鱼作为检验分离菌株毒力的模型。通过人工感染试验发现，H1B6菌株对斑马鱼具有急性感染能力，毒力较强，提示该菌可能是导致半滑舌鳎体表溃疡病的病因之一。在此基础上，今后还需要开展进一步的研究工作，以探索该菌株的致病机制以及对半滑舌鳎的致病力，为半滑舌鳎体表溃疡病的防治奠定理论基础。

(安徽农业科学 2019年05期)