诺氟沙星在草鱼体内的组织分布和药物动力学规律
"诺氟沙星在草鱼体内的组织分布和药物动力学规律
郭海燕1 ,2，陈元坤1，朱林3，张其中2,4*
（1.重庆市水产科学研究所，重庆400020；2.水产科学重庆市市级重点实验室 西南大学生命科学学院，重庆 400715；3.铜梁县水产站，重庆 402056；4.暨南大学水生生物研究所，广州 510632）摘要：本文研究了口灌给药方式下诺氟沙星在草鱼组织中的分布及药物动力学规律，其血清、肌肉、肝脏和肾脏中的药物用反相高效液相色谱法(Re-HPCL)测定。结果表明：在水温 (26±1)℃下，以10mg/kg剂量单次给草鱼口灌诺氟沙星后，肝脏和肾脏中的药物浓度明显大于肌肉和血液中的药物浓度，其血药浓度-时间数据用一级吸收二室模型描述较为合适，吸收半衰期t1/2Ka、分布半衰期t1/2α和消除半衰期t1/2β分别为：0.1468h、0.5224h和82.8811h。关键词：诺氟沙星 草鱼 组织分布 药物动力学
中图分类号：S948
The Tissue Distribution and Pharmacokinetics of Norfloxacin in Grass Carp
Guo Haiyan1,2, Chen Yuankun1, Zhu Lin3,Zhang Qizhong2,4＊
(1.Chongqing fishery Sciences Research Institute, Chongqing 400020 China; 2. Key Laboratorry of Aquatic Science of Chongqing School of Life Sciences, Southwest China University， Chongqing 400715 China; 3. Tongliang Fisheries Station, Chongqing 402560 China; 4. Hydrobiology Institute of Jinan University, Guangzhou 510632 China)
Abstract: The tissue distribution and pharmacokinetics of Norfloxacin (NFX) in grass carp (Ctenopharyngodon idellus L.) were investigated at a single-dosing oral administration of 10 mg NFX kg body weight at the water temperature of (26±1)℃. The drug concentrations in serum, muscle, liver and kidney were determined by Re-high performance liquid chromatography (Re-HPLC). The results were as follows: the drug concentrations in liver and kidney were obviously higher than those in muscle and serum. And the serum concentration-time data were best described as a two-compartment open model with first order absorption, the half-life of absorption (t1/2Ka), half-life of distribution (t1/2) and half-life of elimination (t1/2) were 0.1468h, 0.5224h and 82.8811h, respectively.
Keyword: norfloxacin; grass carp; tissue distribution; pharmacokinetics
诺氟沙星在水产动物中的药物动力学研究可为疾病防治中制定科学使用该药的用药方案提供依据[1,2]。目前已报道诺氟沙星在鲤[3]Cyprinuscarpio、鲈[4]Lateolabrasiaponicus、大黄鱼[5] Psedosciaena crocea、中华鳖[6] Trionyx sinensis、中华绒螯蟹[7] Eriocheir sinensis、斑节对虾[8] Penaeus monodon和南美白对虾[9] Penaes vannamei等水产动物中的药物动力学规律。目前尚未见诺氟沙星在重要淡水养殖鱼类草鱼（Ctenopharyngodon idellus L.）中的药物动力学研究报道。本实验探讨了口灌给药方式下，诺氟沙星在草鱼体内的药物动力学规律，以期对草鱼养殖中的规范用药提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验鱼
健康草鱼，质量(22±2)g，水温(26±1)℃，实验鱼购自重庆市北碚区歇马渔场，试验前驯化2周时间，每日投喂饵料（市购，不含药物）和浮萍，所有试验鱼经抽查表明组织中均不含诺氟沙星。
1.2给药方法及取样
试验前将草鱼随机分为10组，9~12尾为1组，每组3个平行对照，另选数尾作空白对照。给药前按分组编号取出，称重记录。
在(26±1)℃水温条件下，以10mg/kg剂量灌入实验鱼前肠，为防止灌入的药物回吐，可在灌药后将其身体头朝上直立片刻，无回吐者保留试验。给药后第0.25，0.5，0.75，1，2，4，10，20，36，48h各取血液若干(保证处理后每个样品的上清液量为0.5ml)，肌肉、肝脏、肾脏各0.5g。
自尾静脉取血(避免了因断尾取血时带入一些水分或渗出部分组织液而带来的试验误差)，然后以6000r/min离心2min，取上清液0.5ml于-20℃保存，取血后，快速取肝脏、肾脏及躯体两侧背鳍附近的肌肉，充分剪碎，各取0.5g，-20℃保存，直至药物浓度分析。
1.3样品处理及浓度测定
将冷冻保存的草鱼血清、肌肉、肝脏、肾脏自然解冻，10000r/min匀浆2min，用1ml乙腈清洗刀头，再加入2ml乙腈提取（血清无需匀浆，直接用3ml乙腈提取），旋涡混合器上振荡2min，静置15min，8000r/min离心20min，吸取全部上清液于另一试管中。残渣再加乙腈2ml提取，振荡、静置、离心10min后，合并两次上清液，50℃水浴中氮气流下吹干，用流动相溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤后,取20μl进行HPLC分析。色谱条件：流动相为柠檬酸0.05mol/l：乙酸铵1mol/l：乙腈=79:1:20（V/V/V，用三乙胺调pH值到4.0）；流速0.8ml/min，检测波长为278nm，柱温为室温。
1.4标准曲线及工作曲线的制备
称取0.005g干燥恒重的诺氟沙星标准品，先用少许2%醋酸溶液溶解后，转移至20ml棕色容量瓶中，用流动相溶液稀释至刻度，即为100μg/ml的标准品母液。
用流动相溶液稀释标准品母液，分别制成0，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20μg/ml质量浓度的标准浓度系列，以HPLC法分别测定其峰面积，然后以上述浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标作标准曲线,并求出其标准曲线的回归方程和相关系数。
在试管中分别加入0.5ml的血清或0.5g的组织，再依次加入0.5ml标准品溶液（0~20μg/ml），按1.3处理后进行测定,然后以浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标作标准曲线，并求出其标准曲线的回归方程和相关系数。
1.5回收率和精密度
将0，0.05，0.1，2，5，10，20μg/ml不同质量浓度的药物标准液各0.5ml加入0.5ml的空白血清或0.5g的空白组织中，按1.6处理后作HPLC测定。按照公式：
取0.05，0.3，0.1，5 μg/ml不同浓度的诺氟沙星标准液，加入空白血液或组织，按1.4处理后经HPLC测定，比较每个浓度日内/日间3次测定的峰面积变化幅度。按照公式：
式中 ,SD 为标准差。
2.1色谱行为和检测限
在设定的色谱条件下，以HPLC法测定草鱼血清、肌肉、肝脏和肾脏中诺氟沙星含量，基线走动平稳，样品中虽出现杂峰，但无干扰峰，且与药峰分离良好。以引起2倍基线噪音的药量为最低检测限，本法诺氟沙星在各组织中最低检测限为0.01μg/ml或0.01μg/g，符合药动学和残留测定的要求。
2.2线性范围
本实验条件下，诺氟沙星在0~20μg/ml质量浓度范围内线性关系良好。用直线回归法对数据进行分析处理，以一定标准品溶液的浓度作为横坐标，相应的峰面积作为纵坐标，得标准曲线：y=162052.86538x+5403.05921，r=0.99995，且诺氟沙星在草鱼血清、肌肉、肝脏和肾脏中的线性关系良好，其标准曲线的回归方程和相关系数分别见表1。
表1诺氟沙星在草鱼血清及其他各组织中的标准曲线方程和相关系数
Tab. 1 The norfloxacin standard curve equations and coefficients in the serum and other tissues of grass carp
|
|
回归方程 |
相关系数 |
|
血清(serum) |
y=178291.02371x-5487.91248 |
0.9994 |
|
肌肉(muscle) |
y=140026.9459x+1489.74589 |
0.9999 |
|
肝脏(liver) |
y=152872.78181x-4306.42268 |
0.9998 |
|
肾脏(kidney) |
y=142879.95754x+17054.09163 |
0.9987 |
2.3回收率
本试验条件下，诺氟沙星在草鱼血清、肌肉、肝脏和肾脏中回收率的具体情况如表2。由表2可见，此方法下各组织中的回收率均在80%以上，符合药动学研究要求。
表2 诺氟沙星在草鱼血清及其他各组织中的回收率
Tab. 2 The norfloxacin recoveries in the serum and other tissues of grass carp
|
标准液浓度 |
回收率% |
|||
|
血清 |
肌肉 |
肝脏 |
肾脏 |
|
|
0.05 |
77.84 |
73.58 |
80.62 |
81.52 |
|
0.1 |
73.46 |
88.01 |
76.75 |
85.80 |
|
2 |
80.98 |
88.20 |
93.44 |
88.53 |
|
5 |
76.51 |
75.36 |
86.06 |
93.10 |
|
10 |
97.15 |
79.58 |
85.82 |
89.95 |
|
平均值 |
80.41±6.86 |
80.94±6.96 |
82.54±7.22 |
87.78±4.38 |
本实验条件下，诺氟沙星在草鱼血清、肌肉、肝脏和肾脏中的日内变异系数和日间变异系数，结果如表3。由表3可见，此方法下各组织中的变异系数均低于10%，符合药动学研究要求。
表3 诺氟沙星在草鱼血清及其他各组织中的变异系数
Tab.3 The coefficient of variability of norfloxacin in the serum and other tissues of grass carp
|
变异系数 |
血清 |
肌肉 |
肝脏 |
肾脏 |
|
日内 |
6.08±2.05 |
4.39±3.90 |
3.04±3.03 |
3.39±1.13 |
|
日间 |
6.13±1.26 |
6.03±4.76 |
4.45±3.62 |
4.71±2.69 |
2.5.1诺氟沙星在草鱼组织中的浓度分布
在水温(26±1)℃下，以10mg/kg剂量对草鱼单次口灌诺氟沙星后，各组织中的药物浓度随时间变化的情况如图1。
由图1可见，在水温（26±1）℃下，以10mg/kg剂量对草鱼单次口灌诺氟沙星后，肝脏和肾脏中的药物浓度明显大于肌肉和血液中的药物浓度，实测样品中，血清中0.75h时最先达到最大药物浓度，肝脏、肾脏和肌肉约在1h时达到最大浓度，最大浓度值由小到大的顺序依次是：肌肉﹤血清﹤肝脏﹤肾脏，20h时浓度值由小到大的顺序依次是：肌肉﹤血清﹤肾脏﹤肝脏，48h时，肝脏和肾脏中药物浓度高于0.05μg/ml，血清和肌肉中药物浓度低于0.05μg/ml。
2.5.2诺氟沙星在草鱼中的药物动力学规律不同时间的平均血药浓度用一级吸收二室开放模型描述较为合适，其理论方程是：C=2.7418e-1.4314t+0.0099e-0.0158t-2.8627e-4.8358t，其主要 的药动力学参数见表4。由表中可见，吸收半衰期t1/2K、分布半衰期t1/2和消除半衰期t1/2分别为0.1827，0.5081和44.7507h，说明给草鱼口灌诺氟沙星时，吸收和分布比较快，而消除很慢。
表4 单剂量口灌给药后诺氟沙星在草鱼血液中的药动学参数
Tab. 4 The pharmacokinetics values for norfloxacin in the serum of grass carp after single oral administration
|
参数(parameter) |
单位(unit) |
数值(value) |
|
A |
μg/ml |
4.2824 |
|
α |
1/h |
1.4314 |
|
B |
μg/ml |
0.1254 |
|
β |
1/h |
0.0158 |
|
Kα |
1/h |
4.8358 |
|
lag time |
h |
0.1023 |
|
t1/2α |
h |
0.5081 |
|
t1/2β |
h |
44.751 |
|
t1/2Kα |
h |
0.1827 |
|
k21 |
1/h |
0.1048 |
|
k10 |
1/h |
0.2153 |
|
k12 |
1/h |
1.1271 |
|
AUC |
μg·h /ml |
9.2545 |
|
CL(s) |
L/kg/h |
1.0815 |
|
Tmax |
h |
0.4027 |
|
Cmax |
μg/ml |
1.1143 |
|
V/F(c) |
L/kg |
5.2606 |
注：A为分布相的零时截距；B为消除相的零时截距；α为分布速度常数；β为消除速度常数；kα为吸收速度常数；lag time为时滞；t1/2α为分布相半衰期；t1/2β为消除相半衰期；t1/2kα为吸收相半衰期；k12为由中央室到周边室的一级转运速率常数；k21为药物由周边室到中央室的一级转运速率常数；k10为描述药物从中央室消除的一级速率常数；AUC为药时曲线下总面积；CL(s)为体内总清除率；Tmax为达峰时间；Cmax为最大血药浓度；V/F(c)为表观分布容积。
影响药物在水产动物体内分布和药动学的因素有很多，包括温度、药物种类、动物种属、给药剂量等[10,11]。在（17±1）℃时，鲤口灌诺氟沙星（10mg/kg）后，药物经消化道进入血流，吸收半衰期t1/2kα为0.1491h，血药浓度达峰时间为0.73h，此时药物浓度为5.7988μg/ml，分布半衰期t1/2α为3.4071h，消除半衰期t1/2β为77.1239h[3]，说明鲤对诺氟沙星的吸收较快，能达到较高的药物浓度，而消除很慢。在(23.3±0.6)℃时，鲈单次口服诺氟沙星（50mg/kg），主要药动学参数t1/2kα、t1/2α、t1/2β、Tmax、Cmax分别为0.73h、0.961h、15.096h、1.313h、0.25μg/ml[4]，可看出鲈口服诺氟沙星后吸收较迅速，消除较缓慢，但是Cmax值只有0.25μg/ml，远远小于鲤。从上面的数据中可以看出草鱼口灌诺氟沙星吸收分布较快，而消除相对慢，其药动学参数和鲤、鲈有一定的相似性，而中华鳖口服诺氟沙星(50mg/kg)，主要药动学参数t1/2kα、t1/2ke、Tmax、Cmax分别为2.30h、4.24h、4.58h、3.27μg/ml，AUC为41.37mg•h/ml，表观分布容积达到7.39L/kg，可见在中华鳖体内诺氟沙星分布更广泛[6]，说明即使是同一种药物在同样的给药方式下，在不同的水产动物体内药动学特征也会有一定的差异。
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来源:《水产科学》 2009年01期
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