中国拥有世界第一的水产品产量, 也是仅有的养殖产量超过捕捞产量的国家。2016年, 我国的水产养殖产量达5.142×1010kg, 占全球水产养殖产量的60%以上。由于养殖成本的不断提高, 为了增加效益, 水产养殖向集约化方向发展。在传统养殖模式下, 随着养殖密度日益增加, 养殖区域或水体的生态环境严重恶化, 水产动物在养殖环境中可能已经处于亚健康状态, 进而出现了产品质量下降、病害蔓延等问题, 严重影响水产养殖业的可持续发展。以低能耗、高产出、生态环保、综合效益稳定等为特点的水产健康养殖模式, 逐渐成为研究热点， 是水产养殖业发展的一个重要方向。

鱼类健康养殖是指养殖鱼类在某种水体条件下, 通过维持一个高质量的水域环境, 投喂营养平衡的饲料, 达到最佳的生长率、饲料转化率、繁殖率和成活率的养殖, 其内涵是保持或者恢复鱼体健康, 因此如何评价鱼体健康状况尤为重要。健康鱼体的生长速度、饲料利用效率、各器官和组织的各类指标应在正常、合理的范围, 鱼体能够适应所处环境, 并对环境的变化快速做出自我调节,不会出现明显的病理性变化、死亡等。鱼类能否保持健康的状态, 一方面取决于鱼体自身的免疫力,还可能与机体内外环境的平衡状态相关。综合起来, 鱼类的健康, 除了无病以外, 主要体现在鱼类机体体质、行为能力和环境适应力3个方面。

长期以来, 我国水产养殖从业者们往往以有病或者无病来衡量鱼类的健康状况, 这种片面的观点是造成我国水产养殖业轻防重治的原因之一。同预测病害发生的原理相似, 鱼类在从健康状态向亚健康状态转变的过程中, 鱼体的某些指标随之改变, 这些指标就可以用来评判鱼体的健康状况。目前报道的鱼体健康状况评价方法主要包括人工现场观察鱼体形态、抽样化验血液和肝脏生理生化和免疫等指标、免疫器官发育指数法分析、RNA/DNA比值分析、实验攻毒等, 大致分为定性评价和定量评价2种, 而每种方法都存在各自的优势和缺点。

1 定性评价

定性评价是不采用数学的方法, 而是根据评价者对鱼体状态的观察和分析, 直接对鱼体健康状况做出定性结论的判断, 其中包括现场监视和鱼体抽样化验等。

1.1 现场监视

现场监视是最简单直观的鱼体健康状况评价方法。包括观察养殖鱼的体形、摄食状态及游泳状态。健康的鱼体生长发育正常, 体形匀称, 集群性强, 觅食力旺盛, 游动敏捷灵活。但是现场监视需要丰富的养殖经验, 其判断标准还缺乏客观性,一些不明显的变化没有被监视到就可能给养殖场带来巨大损失。

图像处理技术借用计算机图像处理技术对鱼体健康状况进行自动诊断, 实现对养殖现场中鱼类的健康状况进行实时监视, 具有快速、简易、成本低、准确等优点。卢焕达等提出了一种基于计算机视觉的鱼类行为自动监测方法, 通过监测鱼类体色与游动速度的变化, 自动发现由于应激或疾病等引起的鱼类行为异常。鱼类的生长和摄食节律也可以通过计算机自动监测。这些研究对水产养殖业实施水产生物的自动化监测具有借鉴意义。

1.2 鱼体抽样化验

鱼体抽样化验包括体表观察、肝胰脏观察、切片分析等。体表观察只能对养殖鱼类的健康状况进行初步的评价, 是通过观察体表颜色、鱼体鳞片的完整和光亮程度、体表黏液的多少以及身体病态特征等一系列外貌特征作为判断健康状况的依据。肝胰脏是水产动物重要的代谢器官, 肝胰脏的颜色和质地也是反映鱼体健康的重要指标。组织切片分析是将肝脏、消化道等组织材料经过一系列的处理, 在显微镜下进行组织学检测。通过肝脏和肠道的切片可观察和分析鱼体的健康状况。相对于体表观察和肝胰脏观察, 组织切片分析能更准确可靠的评价鱼体的健康状况, 但其操作比较复杂而且需要一定的专业知识。

2 定量评价

定量评价通过数据客观真实地反映鱼体的生长及发育状况, 结果相较于定性评价更加可靠, 具有客观化、标准化和精准化等优点, 包括形体指标分析、血液生理生化分析、免疫力指标检测、指数法分析、RNA/DNA比值分析、人工攻毒检测等。

2.1 生理生化分析

血液生理生化分析血液生理生化分析是通过测定和分析血液中相关生理生化指标, 对被检验动物的健康状况做出评价, 具有简便、快捷等优点, 并且可以直接在活体上取样, 是评价鱼体健康的可靠方法之一。血液生理生化分析主要包括血液常规指标检测和血清生化指标检测。

血液常规指标, 如红细胞数量、红细胞比值、血红蛋白浓度等, 作为鱼体健康评价方法, 已经用于检测如病害、重金属污染、缺氧、高密度养殖等不同胁迫条件下鱼体的生理变化。除常规的分析化学检测外, 还可以通过血涂片分析了解血液红细胞比例、红细胞形态、白细胞数量及比例等, 进而了解鱼体的生理状态。在虹鳟饲料中添加玛咖块茎, 能够提高其血液白细胞数量, 改善鱼体健康状况, 进而增加养殖鱼的存活率。另外, 血液淋巴细胞的降低则会引起免疫抑制, 导致鱼体更易感染病原。然而, 影响血液指标的因素很多,比如养殖鱼的种类、性别、规格、饥饿状态, 养殖水体水质、温度等, 不同的研究之间很难进行比较。比如饥饿状态的虎利齿脂鲤(Hoplias malabaricus)血液红细胞和白细胞都有所下降, 这就限制了该指标作为鱼体健康状况评价依据的使用。

血清生化指标, 包括血清总蛋白、尿素氮、葡萄糖、总胆固醇和甘油三酯含量, 碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)活性等。和血液指标相比, 血清生化指标可以更好地反映免疫刺激物对鱼体的影响, 其与鱼体抗病力的关系也被广泛研究。比如血清总蛋白、葡萄糖、尿素氮和总胆固醇和甘油三酯含量被广泛用于研究不同的饲料成分对鱼体生理状态的影响。AST和ALT活性可以用来指示化学或者脂质过氧化作用造成的肝损伤。鲈(Lateolabrax japonicus)对胆管炎症的反应造成血清ALP活性的提高。已有研究尝试筛选能够用于评价鱼体的健康状况的血清生化指标。通过研究血清生化指标和黄尾鱼(Seriola quinqueradiata)感染细菌后的死亡率之间的关系, 进而研究可评价鱼体健康状况的可靠的血清生化指标, 结果表明血清胆固醇含量与鱼体抗病力有一定相关关系, 血清胆固醇含量较低的鱼更易感病。研究发现, 高密度养殖的真鲷(Pagrus major)血清胆固醇含量明显较低, 感染虹彩病毒后死亡率增加, 说明血清胆固醇的含量可以用于评价鱼体抗病力。目前血清生化指标是较有效的鱼体健康评价方式, 但需要专业人员操作。

免疫力指标检测鱼体免疫力与鱼体健康状况息息相关。参与鱼类非特异性免疫反应的因子主要包括巨噬细胞、粒细胞和细胞毒性细胞等一些具有吞噬作用的细胞, 以及介导一系列免疫或应激反应的蛋白分子, 如补体、细胞因子、趋化因子及溶菌酶和抗菌肽等。这些免疫因子的含量,作为免疫力指标已被广泛用于评价鱼体健康研究。但是在这些研究中, 由于缺失标准化的评价方法, 导致不同的研究结果之间没有一致性, 甚至出现相悖的情况。如在益生菌对鱼体健康和免疫力的影响研究中, Aly等和Wang等发现, 芽孢杆菌等益生菌的投喂或添加可以显著提高罗非鱼的溶菌酶活性, 但在另外一个研究中, 芽孢杆菌的添加并没有影响罗非鱼溶菌酶的活性。这说明目前经常测定的免疫指标还不具备通用性, 常用的鱼体免疫指标检测技术仍需提高。在生产上,鱼体健康状况评价十分重要。因此, 在以免疫指标作为鱼体健康状况评价方法的情况下, 免疫指标的检测方法必须是规范化的, 要有良好的灵敏度、可靠性和易用性。

肝脏生理生化分析肝脏在鱼体健康中占重要地位, 酶的合成与分泌是其主要功能之一, 参与排泄、代谢、解毒和营养吸收等重要生理功能。鱼体组织中的转氨酶(AST和ALT)参与氨基酸代谢, 乳酸脱氢酶(LDH)将丙酮酸催化生成乳酸, 这3种酶活性的变化可以反应肝的功能状态, 当肝脏细胞受到了损害时, 这些酶从肝细胞中释放出来,进入血液系统, 导致肝组织中酶活性降低、血清中酶活性增加。肝脏抗氧化酶活性, 包括过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等也广泛用于鱼体健康评价。该方法也需专业人员操作。

RNA/DNA 比值分析RNA浓度是测定生物生长和代谢率的指标, 而DNA浓度是体现细胞数目的指标, 细胞中DNA含量对环境条件的变化并不敏感, 因此RNA/DNA比值反映了动物的代谢活动,可作为评价鱼类健康状况的潜在指标。由于RNA/DNA比值的变化是体内蛋白质合成状况的体现, 因此, 即使在鱼体的体长、体重尚未明显变化时,RNA/DNA比值可作为仔鱼生长速度的指标。RNA/DNA比值具有种属特异性[44], 被认为是一种极有效的营养指标, 能准确地反映鱼类的营养状态。但这种评价方式会受到核酸提取的质量影响, 且需要专业人员操作。

2.2 指数法分析

目前常见的包括形体指数、免疫器官指数和鱼体健康指数3种。

形体指数形体指标主要有体重/体长、肥满度等。通过研究鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鳊(Parabramis pekinensis)等鱼种的体重与体长的相关关系, 得出鱼种的体重大小能较正确的反映出鱼种质量的优劣。基于智能手机的发展, 陈柏松等建立了一个基于安卓智能手机的黄鳝(Monopterus albus)体长、体重及肥满度的测定系统, 可用于野外实地实时测量。但这些形体指标的比较主要在试验组之间进行, 需要提前了解比较组的养殖条件和养殖规格, 统计养殖鱼类健康状况良好时的各形体指标的变化范围, 才能够诊断状态异常的鱼类。

免疫器官指数免疫器官指数是反映免疫器官发育程度的重要指标, 在无明显病变的情况下,一般来说免疫器官指数越高, 免疫器官发育越完善,机体的免疫力就越强。免疫器官指数包括头肾指数、胸腺指数、肝胰脏指数和脾脏指数等, 是指其重量占鱼体总重量的比例。免疫器官指数常用于研究免疫增强剂对鱼体健康的影响。如玉屏风多糖添加量为0.8—1.6 g/kg时对草鱼的肝胰脏指数无显著影响, 当添加量达到1.6 g/kg时, 试验组的头肾指数和脾脏指数显著高于对照组, 可以起到增强免疫的效果。

鱼体健康指数鱼体健康指数(The fish health condition profile, HCP)最早用于评价虹鳟鱼种的健康状况, 包括对鱼体外部特征如体长和体重的测量; 血液参数如血细胞比容、白细胞比容和血浆蛋白浓度的测量; 内部器官如鳃、假鳃、胸腺形态学观察和脾、肝、后肠、肾、肠系膜脂肪、胆囊胆汁的状态评估等。该评价方法综合了前文中的形态学分析和血液生理生化分析等。Novotny和Beeman通过HCP对王鲑幼鱼进行了健康评价,结果表明其胸腺的异常发育和过高的脂肪含量是受养殖密度影响, 但这些异常现象和鱼体抗病性不相关。刘猛等根据草鱼体表颜色、形体指标、肝胰脏解剖图、肝组织切片及肝功能和肝损伤酶学值等建立养殖了草鱼健康评价指标体系, 发现肥满度、内脏指数、肝胰脏指数、肝脂肪含量、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、甘油三酯、高密度脂蛋白-胆固醇和低密度脂蛋白-胆固醇10个指标及其正常值范围可以用来判定草鱼的健康状况。但健康指数的确立需要对不同的养殖鱼类进行数据采集和统计分析, 工作量非常巨大。

2.3 人工攻毒检测

人工攻毒可以直观地评价鱼体的抗病力, 进而评价鱼体的健康状况。近几年的研究发现, 非特异性免疫反应的提高并不能完全反映出鱼体的抗病力, 而人工攻毒可以更加直接有效的评价鱼体的抗病力。人工攻毒通常有浸泡和注射2种方式。浸泡可以更好地模拟自然感染病原菌的状态,注射法则可以更好的控制攻毒剂量。攻毒效果与病原菌菌株致病力的强弱、环境条件和操作手法等直接相关。采用半致死浓度进行鱼体攻毒是目前常用的人工攻毒方法, 如果攻毒浓度过高, 则会导致累计死亡率提高, 导致实验结果和鱼体的健康程度的相关性降低。由于攻毒所用的菌种、菌株和剂量不同, 不同的研究结果往往也不具有可比性。

2.4 共生菌菌群指示法

由肠道、皮肤和鳃等组成的黏膜系统是鱼类抵御外界有害环境的第一道屏障, 分布在黏膜上的共生菌群与该系统作用的发挥关系密切。共生菌群落结构的失衡可以显著影响宿主的生理和免疫状态。当鱼体黏膜系统共生菌的组成处于相对稳定的动态平衡时, 这些共生微生物对鱼体健康有益, 而当共生菌群中的有害微生物过度繁殖, 微生物的结构平衡最终会被打破, 不利于鱼体的健康和生长。研究表明, 菌群的定植可以提高斑马鱼(Brachydanio rerio)仔鱼的中性粒细胞数, 诱导编码促炎和抗病毒介质基因的表达, 提高鱼体对病毒感染的抵抗能力, 还可以诱导斑马鱼肠道碱性磷酸酶的表达, 调节肠道炎症反应。对大菱鲆(Scophthalmus maximus)体表黏液的菌群结构研究发现,健康大菱鲆的体表和垂死大菱鲆的体表细菌组成有很大差异, 比如发光杆菌属细菌(Photobacterium angustum)和坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)等仅存在于健康鱼的体表。通过对比攻毒无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)前后的罗非鱼皮肤和鳃的菌群结构, 发现存活的罗非鱼体表菌群结构和未感染病原前无显著差异, 而垂死罗非鱼的体表菌群多样性下降, 其中弓形杆菌属(Arcobacter)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)和弧菌属(Vibrio)等含量显著下降。黏膜共生菌菌群结构特征能够在一定程度上反映鱼体的健康状况, 两者之间存在相关性。高通量测序技术的发展为了解鱼体共生菌群提供了可能, 未来可以通过鉴定某种或者某一类细菌, 了解鱼体的健康状况, 筛选出鱼体健康的指示菌群。

3 展望

鱼体的健康状况与养殖业效益直接相关, 因此,鱼体健康状况的评价显得尤为重要。通过分析某些指标可以预判养殖鱼类是否向亚健康状态过渡,一旦出现异常, 能够及时采取预防措施, 降低或者避免鱼体发病的可能。综合当前研究结果, 发现单一的评价指标在灵敏度和精确度上存在一定缺陷,很难通过单一指标对鱼体健康状况进行全面评价。因此, 多指标结合的评价方法将是未来研究的趋势。

随着水产养殖业集约化、工厂化步伐的加快,建立灵敏精确的养殖鱼体健康评价方法将是产业发展的一个重大需求。此外, 按养殖类型有针对性地监测和评价, 建立适合池塘、水库和湖泊等自然水体、工厂化养殖水体或网箱养殖的鱼体健康评价方法也是未来的发展方向之一。基因测序技术的飞速发展, 测序费用大大降低, 且能够在短时间内获得分析结果, 快速知晓环境微生物和鱼体黏膜免疫系统共生菌的组成和变化, 以预判环境和鱼体的健康状况。计算机图像处理技术能够实时观测鱼体行为, 及时发现异常个体, 结合基因测序技术,理论上能够客观准确的评价鱼体及环境健康状况,为提前做好病害防控和养殖环境的改善提供可能。