鲤浮肿病检测方法实验室间比对的结果与评价

陈孝宇，陈 鑫，王津津，范引光，曾宪东，郑 剑

(1.武汉海关，武汉 430050；2.深圳海关，深圳 518045；3.安徽医科大学公共卫生学院，合肥 230032)

鲤浮肿病毒(carp edema virus)于1974年在日本新泻的一个锦鲤养殖场首次发现，自2009年开始，在英国、法国、德国、波兰等欧洲国家，陆续发生了鲤科鱼类因感染CEV而爆发性死亡[1-3]。在亚洲的印度和韩国也相继出现鲤浮肿病感染病例报道[4，5]。2014年7月，在北京房山某养殖场发现鲤浮肿病临床症状疑似病例，经电镜观察和PCR产物测序及比对，确诊该病是由CEV感染引起的鲤鱼浮肿病[6]。感染CEV的发病鱼身体浮肿，表现出强烈的嗜睡症状，浮于水面或沉入池底，器官水平可见鳃损害、凹眼、皮肤损害等症状，因此该病又被命名为锦鲤昏睡症(koi sleepy disease， KSD)，该病发病水温范围广，7～25 ℃均有报道。CEV是一种双链DNA病毒，属于痘病毒科，根据CEV 4a基因片段遗传分析，将其分为三个基因型：基因型I和IIb型仅感染普通鲤，IIa型感染普通鲤和锦鲤[3，7]。锦鲤感染CEV后有典型的临床症状，导致很高的致死率；但普通鲤对CEV却有很强的耐受性，种群致死率较低[8]。随着CEV的流行趋势渐广，在不同应用场景下，最适检测方案的选择尤为重要，但目前尚未有CEV现场快速检测的方法报道。本研究旨在利用实验室间比对，比较鲤浮肿病不同检测方法的检出限，为防疫机构提供有效的检测手段，为开展流行病监测奠定方法基础。

1 材料与方法

1.1 病鱼样品

2017年6月收到来自湖南省的3个样品，每个样品随机采样锦鲤150尾，采样水温25～27 ℃。部分锦鲤有昏睡症状，以及眼球凹陷和体表溃烂等其他临床症状。

1.2 主要试剂与仪器

基因组DNA提取试剂盒购自天根公司；Taq酶购自Takara公司，Bst酶购自NEB公司；引物、探针均由Invitrogen公司合成。PCR仪和荧光PCR仪购自ABI公司，电泳仪和凝胶成像系统购自Bio-rad公司。

1.3 核酸提取

取鱼鳃和肝脾肾等内脏组织，低温研磨，采用基因组DNA提取试剂盒抽提DNA，方法参见说明书，-40 ℃保存备用。

1.4 CEV的套式PCR检测方法

采用Matras等[3]建立的CEFAS套式PCR方法，第一轮扩增引物序列为：F1：5′-ATGGAGTATCCAAAGTACTTAG-3′，R1：5′- CTCTTCACTATTGTGACTTTG -3′；第二轮扩增引物序列为：F2：5′- GTTATCAATGAAATTTGTGTATTG -3′ R2：5′- TAGCAAAGTACTACCTCATCC -3′。两轮扩增反应条件一致：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。配置1.5%琼脂糖胶， PCR扩增产物电泳后，凝胶成像系统观察结果。

1.5 CEV的 LAMP检测方法

采用经鉴定的CEV核酸，以及选取锦鲤疱疹病毒，鲤疱疹II型病毒和鲤春病毒血症病毒等常见鲤科鱼病毒作为参照进行特异性实验。LAMP扩增的外引物为F3：5′- GTTATCAATGAAATTTGTGTATTG-3′，B3：5′- CAAATTTGAGATTACATTCTGTGG -3′；内引物为FIP：5′- TGGGAAGGATTTTATGCTAATGGAAATCGTTTGTTACCTTTTGTAGT-3′，BIP：5′- TGTAGCATTTCCTAGTTTGTATGGCCAAATTCCTCAAGGAGTTGC -3′。反应条件为63 ℃等温扩增60 min，80 ℃终止反应5 min。琼脂糖电泳观察结果。

1.6 CEV的荧光定量检测方法

荧光定量PCR采用Matras等[3]建立的CEFAS qPCR方法，引物为F:5′-AGTTTTGTAKATTGTAGCATTTCC-3′，R:5′-GATTCCTCAAGGAGTTDCAGTAAA-3′，探针为5′-FAM-AGAGTTTGTTTCTTGCCATACAAACT-BHQ1-3′，反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。

1.7 室间比对方案

参试实验室需分别对所分配到的4份样品进行核酸浓度测量，并选择不同的基因扩增方法进行检测，对4份样品分别作出定性的判定，并且要求10倍梯度稀释阳性样品，进一步比较方法之间检出限的差异。

1.7.1 样品

设计阴性和阳性两种CEV核酸样品：阳性样品为含CEV病毒核酸的基因组，由感染CEV的病鱼鳃组织中提取；阴性样品为感染白斑综合征(white spot disease，WSD)的克氏原螯虾基因组。将提取的核酸溶于TE溶液中，混匀后再分装而成，-40 ℃冷冻保存。按照《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》所规定的检验方法和要求，随机选取待检样品进行定性检测，并对阳性样品进行核酸浓度的均匀性和稳定性检测。

分别从阳性样品中随机抽取了10份样品进行均匀性检测。稳定性检验跨度6 d，测定时间为每天，设置三个模拟环境：低温组4 ℃，常温组25 ℃，高温组37 ℃。每份样品采用紫外分光光度法进行浓度检测，重复检测2次。

1.7.2 检测方法：

套式PCR、LAMP和荧光定量方法参照1.4、1.5和1.6。

1.7.3 参试实验室

对每个参试实验室赋予唯一性代码，参试实验室均以代码表示，样品分发、结果报告等也均以代码传递。全国有10家实验室报名参加本次室间比对(表1)，其中原检验检疫系统实验室7个，以及水产科研院所2个和地方水产机构的实验室1个。

表1 参试实验室地区分布Tab.1 Regional distributions of the inter-laboratory comparison

续表

2 结果

2.1 样品CEV检测鉴定

电泳可见第一轮套式PCR无明显扩增(图1

左)，第二轮产物大小约为478 bp(图1右)，使用DNAman软件进行序列比对，PCR产物测序结果与编码CEV膜蛋白的4a基因的同源性(登录号：KX25404.1；分离株：55-2013)高达97.90%(图2)，显示三个锦鲤样品均被CEV感染。

图1 CEV套式PCR检测结果Fig.1 Nest-PCR results of CEV detection

图2 套式PCR产物序列比对Fig.2 Sequence alignment of nest-PCR products

2.2 LAMP特异性

CEV病毒核酸扩增出明显梯形条带，锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus，KHV)、鲤疱疹2型病毒(cyprinid herpesvirus 2，cyHV-2)、鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carp virus，SVCV)样品均未产生有效扩增(图3)，显示LAMP方法特异性良好。

图3 LAMP特异性结果Fig.3 Specific results of LAMP

2.3 测试样品的均匀性和稳定性评价

阳性和阴性样品的CEV定性检测结果全部相符，对阳性样品核酸浓度值经单因子方差统计分析：计算得F阳=0.650，查表得F0.05(9，10)=2.35，F阳显著小于F0.05(9，10)，结果表明在0.05显著性水平时，阳性样品是均匀的，平均浓度为679.659 μg/mL(表3)。

表3 阳性样品核酸浓度均匀性实验Tab.3 Test for homogeneity of nucleic acid concentration of positive samples

采用t检验法评定样品的稳定性，样品存放6d后检测结果计算：t低温=0.732，t常温=0.491，t高温=0.466，均小于t0.05/2，12=2.179。表明所有样品经模拟低温、常温、高温运输6 d，检测结果无显著性变化，样品稳定性良好(表4)。

表4 阳性样品核酸浓度稳定性实验Tab.4 Test for stability of nucleic acid concentration of positive samples

2.4 实验室比对结果统计

本次室间比对共收到10个参试实验室的结果报告，经与已知结果值对照，参试实验室均上报了正确的定性检测结果，其中有9家选择了套式PCR检测方法，10家全部都选择了荧光PCR检测方法，2家选择了LAMP方法。所有检测限判定的有效结果统计见图4，计算其稀释倍数的加权平均值可得：LAMP法为50倍稀释，最高可达102倍稀释；荧光PCR法为380倍稀释，最高可达103倍稀释；而套式PCR法为1 225倍稀释，最高可达到104倍稀释，其检测限可低至6.8×10-10g核酸样品。

图4 室间比对检测限Fig.4 Detection limit of inter-laboratory comparison

3 讨论

实验室间比对其目的除了确定实验室进行特定检测的能力以外，可通过对结果数据进行分析，确定新的检测方法的有效性和可比性[9]；而能力验证是利用实验室间比对，按照预先制定的准则开展的活动。在动物检疫领域，由国家认监委等机构组织的能力验证，针对病原的核酸检测主要为定性比对，仅部分酶联免疫吸附检测方法为定量比对，其目的是评价参加者的能力，其结果运用于检验检测机构的认可和资质认定。本研究设计定量比对方案，并且组织了10家实验室进行样品的定性判定，在保证阳性样品CEV核酸浓度均匀稳定的前提下，对不同方法的检测限结果进行统计分析。

目前尚未发现和建立敏感细胞系，无法进行CEV病毒分离实验，检测手段主要是核酸检测。本次实验室间比对采用CEFAS建立的套式和荧光PCR方法[10]，其引物设计在p4a基因的相对保守片段上，是目前实验室条件下，检测已知CEV全部基因型的最佳方法。Oyamatsu等[11]建立的套式PCR方法，检测基因型I型CEV时，结果显示有杂带干扰，无法有效判定结果，在检测IIa型时有漏检。Adamek等[12]建立的荧光PCR方法，在检测I型CEV时，假阴性结果较多，且IIa型有漏检。

荧光PCR法无需进行扩增产物电泳，利用收集荧光探针信号来判定靶基因扩增与否，该方法实验流程更少，但对仪器成本要求更高，且荧光探针的成本要远高于引物。套式PCR是传统的基因扩增方法，两轮PCR可有效扩增靶基因，且产物可

经测序进一步验证结果可靠性。由该次室间比对的全部参试结果统计分析可得，CEFAS套式PCR方法灵敏度最高，适用于实验室检测；LAMP法快捷有效，对仪器要求最低，可适用于现场检测。但此次比对结果显示，LAMP法检测限尚不够低，须通过设计环引物和调整扩增体系中甜菜碱浓度等方法，进一步优化反应条件，提高其检测灵敏度。

目前CEV的全基因组序列尚未公布，遗传背景也未完全了解，急需搜集阳性样品和开展流行病学调查，进行毒株进化分析，以更好地开展鲤浮肿病防治研究。本研究建立了现场快速检测方法，同时为在不同应用场景下，选择CEV最适检测方法提供了理论依据。