施礼科，叶 键，王 力，姜路辛，蒋 静

(杭州市农机技术推广中心，浙江杭州 310017)

南美白对虾是当前世界上养殖规模最大、产量最高的对虾，具有肉质鲜美、抗病力强、生长迅速等特点。随着养殖面积的扩大和集约化生产的发展，养殖环境不断恶化，病害频发，极大地制约了南美白对虾养殖产业的发展，其中十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，以下简称DIV1)是近年来流行的主要病原之一。DIV1感染可引起养殖对虾短时间内暴发大面积死亡，造成巨大的经济损失。2020年我国农业农村部、海关总署正式将DIV1列位二类疫病。

2021年，杭州市农机技术推广中心选取了几家典型的南美白对虾养殖场进行DIV1 跟踪检测，其中一家养殖场在养殖后期加注外源河道水两天后发生病害。根据发病前场内对虾检测均呈现病毒阴性的情况，笔者对可能的病毒来源进行了分析，并取样检测，初步发现外源水为重要传染来源。同时进行了实验室感染验证，现将相关情况总结如下。

一、检测样品获取

在杭州市设立南美白对虾跟踪监测点3个，放苗前及放苗后每月对场内对虾取样检测DIV1。取样方法按照《水生动物产地检疫采样技术规范》(SC/T 7103-2008)规定进行，取苗时尽量选活力较弱的虾苗。每份样品加贴采样标签，并填写《虾苗现场采样记录表》。河道水病毒采取直接取水100微升进行检测。

二、检测方法

DNA 提取使用Qiagen DNA Mini Kit 试剂盒，使用套式PCR 方法对获取样品进行DIV1 检测。第一步扩增引物SHIV-F1：5＇-GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT-3＇和SHIV-R1：5＇-TCGTTTCGGTACGAAGATGTA-3＇；第二步扩增引物SHIV-F2：5＇-CGGGAAACGATTCGTATTGGG-3＇和SHIV-R2：5＇-TTGCTTGATCGGCATCCTTGA-3＇。第一步扩增程序为95℃变性；95℃30 秒、59℃30 秒、72℃30 秒，35 个循环；72℃延伸2 分钟。第二步扩增程序为95℃变性；95℃30 秒、59℃30 秒、72℃20 秒，35 个循环；72℃延伸2分钟。

PCR 产物经电泳后，回收第二步扩增阳性条带，送Takara 公司进行克隆测序。测序所得序列通过NCBI的BLAST检索系统进行序列同源性分析。

三、实验室感染模型构建

实验用虾购自杭州市某淡化苗种场，经检测未携带DIV1。饲养密度为每28 升水体养殖40 尾，饲养至3厘米规格后进行人工感染实验。人工感染分实验组和对照组，每个组别各设3 个养殖单位。实验组按养殖水体1/3 的量加入受污染的河道水，之后实验组和对照组按每天两次正常投喂饲料；7 天后每个养殖单位取10 尾虾，解剖获得肝胰腺，混合后检测DIV1。

四、结果与分析

1.发病养殖场病样诊断及外源河道水检测

病虾出现空肠、空胃、肝胰腺颜色变浅萎缩、体色变红等症状(图1)，游动能力和反应减弱。对发病养殖场内虾苗、外源河道水、病虾肝胰腺检测DIV1，第一次扩增外源河道水和发病虾肝胰腺呈现阳性(图2)，其中发病虾肝胰腺呈现强阳性；扩增虾苗(苗池加注了外源水)、外源河道水、发病虾肝胰腺均呈阳性(图3)。结合症状初步判断，病虾为十足目虹彩病毒病，场内虾苗(苗池加注了外源水)为DIV1 弱阳性，外源河道水为DIV1阳性。

图1 病虾

图2 套式PCR第一步扩增

图3 套式PCR第二步扩增

2.实验室感染结果

实验组3个养殖单位南美白对虾肝胰腺第一次和第二次扩增均呈DIV1 阳性，对照组3 个养殖单位南美白对虾肝胰腺第一次和第二次扩增均呈DIV1 阴性(图2、图3)

3.阳性产物测序结果

阳性产物测序所获得序列长度及BLAST结果见表1，所有阳性产物测序结果均为DIV1 ATPase gene。

表1 阳性产物测序结果

五、讨论

该批次发病南美白对虾在放养前对虾苗进行过检测，未检出DIV1，跟踪检测结果也一直呈现阴性，换水两天后暴发十足目虹彩病毒病，且外源河道水DIV1 呈阳性。结合实验室人工感染实验验证，初步判断此病例为加注受污染的外源河道水引发。南美白对虾养殖后期通常为晴热高温天气，养殖户往往会加注外源水对养殖池塘进行水量补充，因此，加注外源水时需谨慎，最好先经过检测，确保加注的外源水不携带病原。

跟踪检测中发现，发病场同时用携带DIV1 的水源对成虾和虾苗的养殖塘进行水量补充，成虾池暴发病害，苗种检测呈弱阳性。后期进一步跟踪这批阳性苗种，30 天后检测DIV1，结果呈阴性，推测养殖后期加注新水对成虾造成应激而发病。而虾苗检测结果呈弱阳性可能为肠道内携带病毒导致，实际未感染，因此后期检测结果为阴性。

继续饲养实验组已感染DIV1 的南美白对虾至后期，该批南美白对虾始终未出现发病症状，这表明DIV1 发病需要一定的条件。实验室养殖环境比较稳定且单一，养殖南美白对虾应激少，推测为后期不发病的原因之一。