在养鱼业中，传染性造血器官坏死病(IHN)是发病率较高的疾病之一。随着进口虹鳟和养殖鳟鱼行业的发展，可能会导致传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的传播。世界动物卫生组织(WOAH)已将其纳入《水生动物卫生法典》，在我国，农业农村部发布的《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》将其列二类动物疫病，是一种必须要上报的动物疫病。

一、背景

四川省雅安市龙仓沟某养殖场暴发了一场疾病，病鱼及濒死鱼体重0.3～1.12 克。在暴发期间，大约有7 万尾鱼死亡。收集典型的临床症状，并加冰送至四川农业大学鱼类疾病重点实验室，以确定病因。

二、实验室诊断

1.临床症状 发病虹鳟表现出体色发黑、精神不振或无规则乱冲乱撞、肛门处拖着不透明或棕褐色的假管状黏液粪便(图1)。经解剖观察发现：病鱼的肝、脾、肠等部位出现弥漫性充血(图2)。

图1 病鱼体色发黑，肛门部位挂着一些不透明或者呈棕褐色的类管状黏性排泄物

图2 病鱼的肝、脾、肠等部位出现弥漫性充血

IHN的临床体征包括脏器内有严重的瘀点和瘀斑出血，腹水中有血，肝和鳃呈苍白色，症状是拖着一长串粪便。IHNV 在32℃或更高的温度下容易灭活，因此不会对鸟类和哺乳动物构成健康风险。

2.组织病理学诊断 取具典型症状的发病鱼制作组织病理切片，H.E染色，置于光学显微镜下观察。结果发现，在头肾实质大面积变性、坏死，大量炎性细胞浸润(图3A)，在发病鱼的上皮细胞胞浆内可形成嗜酸性包涵体(图3B)。

图3 发病鱼的上皮细胞胞浆内可形成嗜酸性包涵体

3.PCR检测 参照williams K的方法合成核衣壳蛋白基因引物(Williams K,1999)，引物序列F:GTTCAACTTCAACGCCAACAGG， R:TGAAGTACCCCACCCCGAGCATCC，该引物由上海生物工程有限公司合成。对发病明显的鱼，无菌采集其肝脏、脾脏、肾脏和肠道组织，按照TRIzol 试剂盒操作说明快速提取RNA。然后使用PrimeScriptTMRT 试剂盒说明书完成总RNA反转录，合成cDNA后进行PCR反应流程。PCR 反应体系为Mix-reaction buffer 12.5 微升，上下游引物各0.5 微升(10 微摩尔/升)，加入cDNA 2 微升(10 纳克/微升) 作为模板，9.5 微升dd H 2O。PCR 反应程序为：94℃预变性4 分钟；94℃变性1 分钟，55℃退火1 分钟，72℃延伸1 分钟，共30 个循环；最后72℃延伸10 分钟。接着，从扩增后的产物中取5微升，加入到事先制好的1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳电压为220伏，于凝胶成像系统观察分析PCR扩增结果(图4)。结果显示在患病虹鳟的肝脏、脾脏、肾脏、肠道组织均扩增出一条特异性条带，大小为371 bp，这与笔者预期的片段大小一致，而阴性对照样本的泳道上病未出现明显条带。之后应用DNA 纯化试剂盒对PCR 产物进行纯化处理后，将纯化产物送上海生物工程有限公司进行测序，将测序结果与GenBank 中已知的核酸序列进行了BLAST 比对，比对结果显示该序列与GenBank 数据库中IHNV的核衣壳蛋白基因有98%的同源性。

图4 RT-PCR检测IHNV病毒

4.人工感染实验 从濒临死亡的虹鳟鱼身上选取肝脏和肾脏组织，使用无菌的生理盐水以1∶5(M/V)的配比，在冰上进行均质化，然后在4℃的低温下，按照3 000、6 000和9 000转/分递增分度离心10 分钟，再利用0.22 微米的滤膜过滤取得上清液。实验分健康组和实验组两组，每组10 尾。实验组虹鳟每只注入0.2毫升的均质液，而对照组虹鳟则注入0.2 毫升无菌生理盐水。在实验过程中，将水温维持在13～15℃，并连续记录两周的死亡率。实验组的虹鳟在注射后的第4 天开始死亡，至第6 天时，死亡率已达80%；其死亡时的症状呈现为急性，临床症状与自然病死鱼相似，对照组则全部存活(图5)。

图5 病毒混悬液人工感染试验结果

三、结论

经过对发病虹鳟组织H.E 染色、PCR 检测和回归感染试验，确诊该群虹鳟因传染性造血器官坏死病毒感染发病。

四、讨论

本实验对发生在四川雅安市龙仓沟某养殖场部分虹鳟进行了实验诊断。该养殖场所养殖的虹鳟有身体颜色加黑、无精打采或乱冲乱撞、肛门处排泄出不清晰或泥黄色的管状黏性便等异常表现。为了确认虹鳟患何种疾病，笔者从表现出异常的虹鳟身上采取了肝脏、脾脏、肾脏和肠等组织，进行虹鳟病毒疾病检测。研究结果显示，患病鱼的细胞质内有能形成嗜酸包涵体的上皮细胞。通过PCR法的检测，成功从肝脏、脾脏、肾脏和肠道组织中扩增出了具有传染性造血器官坏死病毒核外壳蛋白基因。通过人工感染实验，结果发现发病鱼的组织液能够引发健康鱼感染传染性造血器官坏死病。因此，结合该场的流行病学、临床症状，确诊该场的虹鳟死亡系传染性造血器官坏死病毒感染所致。

五、预防与控制措施

一是加大对种苗和主要疾病的监测力度。我国虹鳟养殖业面临着养殖规模较大、种类繁多、种苗来源复杂的情况。疾病的传播途径亦很复杂，产地的检疫体系有待完善。必须加强对种苗和主要疾病的监测，对进口和国内销售的种苗进行实验室检测，避免带病毒种苗和染疫卵进入养殖环节。同时，需要及时了解疾病的动态，为渔民和虹鳟养殖业者提供技术支持和预警。

二是实施疾病预防性措施，因为目前尚无针对虹鳟病毒病的高效治疗手段，主要依赖的是预防策略。比如，购买鱼苗时必须要求商家提供检疫合格证书；在鱼卵运到后，需要使用有机碘进行15 分钟的消毒处理；合理调节水温，将水温维持在16～20℃；定期对养殖场所和使用的工具进行消毒；喂养过程中，给鱼喂食能够增强免疫力的中草药及生物制剂等。

三是优化防疫应对措施。渔业推广技术部门需增强对养殖和防控疫病技术的指导力度，对感染病症的鱼塘进行实时的隔离，对死去的鱼及时进行无害化管理，养殖工具须一池一用，防止交叉感染，养殖排水处理消毒后才可排放。

四是加快打造水产生物无特定疫病的疫苗繁育场所，该建设可以从源头上遏制疾病的扩散。考虑我国彩虹鳟养殖的具体情况，要设立一系列非IHNV 的疫苗繁育场所，有力地管理受精卵、饲料、苗种、助养物等相关环节，尽最大限度地阻止疾病的传播，有效抑制疾病的发生和蔓延。