金鱼(Carassius auratus)咽部寄生洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)的分子鉴定和系统发育分析

郭 睿，张善霹，江小斌，王 伟，王洪城，蔡雷鸣，杨小强

(福州市海洋与渔业技术中心，福建 福州 350007)

粘孢子纲(Myxosporea)类群是一类种类繁多、分布广泛的后生动物寄生虫，已鉴定的种类约2 200种，其主要寄主为鱼类[1-2]，也可寄生于昆虫、两栖类、爬行类及哺乳动物等[3-4]，是水生动物养殖中的重要寄生虫病原。碘泡虫在广义上泛指胞质内含有嗜碘泡的一类粘孢子虫；狭义上指碘泡科(Myxobolidae)的种类，为粘孢子纲最大的一科，该科种类及相关类群在属和种阶元的分类问题上一直存在争议[5]。

金鱼(Carassiusauratus)隶属于硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、鲫属，是我国传统的名贵观赏鱼类和人们乐于饲养的观赏鱼类。金鱼在养殖过程中易受到寄生虫、细菌和病毒等病原的侵袭，不仅影响观赏价值，严重时还会引起死亡，造成较大经济损失。金鱼养殖中常见寄生虫有多子小瓜虫(Ichthyophthiriusmultifilis)、车轮虫(Trichodinaspp.)、指环虫(Dactylogyrusspp.)和粘孢子虫，其中粘孢子虫中的碘泡虫寄生部位在鳃较为常见，未见有寄生在金鱼咽部的碘泡虫报道。

在2018年开展福州地区金鱼病害监测调查中，笔者首次发现某养殖场所采集部分金鱼的咽部存在大量粘孢子虫(碘泡虫)，为确定病原，对其使用18SrDNA和ITS-5.8S基因进行了分子鉴定及系统发育树的构建和分析，以期为金鱼粘孢子虫病的防控提供理论参考和技术支持。

1 材料与方法

1.1 样本采集和保存

金鱼病样采自福州地区某金鱼养殖场，随机采样20尾，体质量5～10 g。采样时水温27～29℃，病鱼离群独游、游动乏力、浮头消瘦。鳃丝及体表黏液水封片未见寄生虫，但发现部分鱼体咽部发红略肿大，将病鱼鳃盖沿鳃弓线剪开，可见咽部存在大量白色包囊，刮取包囊制备水封片使用Zeiss Axio Imager A2显微镜观察拍照，发现大量碘泡虫。吸取部分虫体使用95%乙醇固定后，-20℃保存备用。

1.2 虫体基因组DNA的提取

将95%乙醇固定的部分孢子，5 000 r/min离心10 min后去除上清，使用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen，德国)按照说明书操作提取基因组DNA，标记为FZCL18，作为寄生虫分子鉴定模板，-20℃保存备用。

1.3 虫体目的片段的克隆和测序

使用C1000 Touch基因扩增仪(Bio-rad，美国)进行PCR。扩增18SrDNA基因所用引物参考Andree等[6]，扩增ITS-5.8S基因所用引物参考李丹等[7]，引物序列、退火温度及扩增片段大小见表1，具体为94℃预变性5 min，运行32个循环，包括94℃变性30 s、52℃(或57℃)退火30 s、72℃延伸100 s(或30 s)、72℃充分延伸7 min。PCR反应体系(50 μL)包括：Go Taq Green Master Mix(Promega，美国)25 μL，25 mM的引物各1 μL，模板DNA 1 μL，用去离子水调整终体积至50 μL。PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳后使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit(Omega，美国)切胶回收目的片段，参照pMD18-T克隆试剂盒的操作步骤对目的片段进行连接和转化。经菌落PCR筛选阳性克隆后提取质粒使用ABI 3730 DNA 测序仪测序，并用Mega 5.2对测序结果进行校正。

表1 PCR反应所用引物及目的片段大小

1.4 系统发育树的构建和分析

将FZCL18的18SrDNA和ITS-5.8S基因序列与GenBank中已报道核酸序列进行在线BLAST分析，调出与所测序列同源性较高的核酸序列，并参照刘晓聪等[2]下载相关虫株对应序列。将上述序列使用Mega 5.2完成序列比对后，以相近虫属尾孢虫(Henneguyaspp.)或单极虫(Thelohanellussp.)为外群，采用临接近法(Neighbor-joining method，NJ)构建系统发育树，通过自举分析(Bootstrap)进行置信度检测，自举次数1 000次，以估算内分支支持率。

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2 结果

2.1 虫体形态

孢子正面观察呈梨形，缝面观察呈梭形，前端稍尖后端钝圆。孢子长为14.5～18.0 μm，平均值为(16.0±0.8)μm；孢子宽8.5～11.0 μm，平均值为(10.1±0.8)μm，有2个大小略有差异的极囊，极丝圈数为6～7(图1)。

注：A为光学显微镜下孢子形态，标尺=20 μm；B为单孢子经数码放大图片。

2.2 虫株18S rDNA基因和ITS-5.8S基因序列分析

虫株FZCL18的18SrDNA基因测序结果经校正后获得长度为1 353 bp的序列(GenBank登录号为MT303850)，与GenBank中已报道的洪湖碘泡虫(M.honghuensis)和瓶囊碘泡虫(M.ampullicapsulatus)的对应序列同源性较高，序列相似性在97.27%～98.08%，FZCL18与洪湖碘泡虫在1 353个碱基中有26个差异位点；ITS-5.8S基因测序结果经校正后获得长度为480 bp的序列(GenBank登录号为MT303857)，因GenBank中暂未收录洪湖碘泡虫对应序列，故BLAST后发现与本文虫株序列相似性最高的为GenBank中收录的2株瓶囊碘泡虫的对应序列，序列相似性在94.58%～94.80 %之间，FZCL18与瓶囊碘泡虫在480个碱基中有25个差异位点。

2.3 依据18S rDNA基因和ITS-5.8S基因的系统发育树分析

结合比对结果，选取相关碘泡虫属虫株，采用NJ法基于18SrDNA和ITS-5.8S基因序列构建的系统发育树如图2和图3，可见虫株FZCL18与多株报道的洪湖碘泡虫聚类，且具有较高Bootstrap值。在依据18SrDNA序列构建的系统发育树中，FZCL18与洪湖碘泡虫和咽碘泡虫(M.pharynae)聚为一个分支，在依据ITS-5.8S序列构建的系统发育树中，FZCL18与瓶囊碘泡虫分别形成一个分支，没有聚类。

3 讨论

粘孢子虫是一类世界性分布的动物寄生虫，主要寄生于鱼类。碘泡虫(Myxobolusspp.)是粘孢子虫中的最大类群，全世界报道850多种[8]，我国记录有320余种，其中寄生鲫(C.auratus)的碘泡虫种类最多，达到50余种。部分碘泡虫种类寄生鱼类后引起严重的碘泡虫病，导致鱼类生长缓慢、畸形甚至致死[9]。其中寄生在异育银鲫咽部的洪湖碘泡虫是异育银鲫“喉孢子虫病”的病原，给其养殖带来严重经济损失，因Liu等[10]最早在湖北洪湖地区发现，遂鉴定命名为洪湖碘泡虫(M.honghuensisn.sp.)。同年陆宏达等[11]报道一例江苏盐城地区池养异育银鲫咽寄生碘泡虫病原，命名为咽碘泡虫(M.pharynaen.sp.)，并认为该寄生虫特异寄生在异育银鲫口咽腔上颚的咽组织内，具有寄主和寄生咽部的专一性。之后，刘晓聪等[2]在河南龙湖地区发现异育银鲫的鳃部感染洪湖碘泡虫，但未见形成孢囊，没有造成严重病害。以往有关洪湖碘泡虫的报道，其寄主皆为异育银鲫，主要寄生在咽部，未见有寄生在金鱼咽部的碘泡虫报道。笔者在福州地区某池养金鱼的咽部检出一种咽寄生的碘泡虫，从孢子形态上观察，与Liu等[10]和陆宏达等[11]描述的洪湖碘泡虫或咽碘泡虫相似，从寄生部位和形态上可初步判断本研究碘泡虫为洪湖碘泡虫或咽碘泡虫。

由于碘泡虫属种类繁多以及种间形态结构的相似性，仅通过显微观察依靠孢子形态学对碘泡虫属种类进行分类鉴定存在不确定性，故对本文虫株进行分子鉴定。除了在碘泡虫属等粘孢子虫中广泛应用的18SrDNA序列，还使用了ITS-5.8SrDNA序列外，后者包含的变异区域较多，适合于种间和种内差异研究，可用于相似物种的区别和鉴定[7，12]。在ITS-5.8SrDNA序列的扩增中，选用的引物为李丹等[7]报道的洪湖碘泡虫特异性检测方法中的引物，具有较高的特异性和灵敏度。本文碘泡虫18SrDNA测序结果显示与洪湖碘泡虫对应序列的相似性在98.08%，依据18SrDNA构建的系统发育树中，FZCL18与洪湖碘泡虫聚为一支，其中咽碘泡虫与洪湖碘泡虫聚在一起，暗示二者可能是同物异名，与刘晓聪等[2]认为二者是同一物种的结论一致。ITS-5.8S测序结果显示与瓶囊碘泡虫对应序列的相似性小于95 %，而GenBank中未见报道洪湖碘泡虫或咽碘泡虫的ITS-5.8S序列，故在依据ITS-5.8S构建的系统发育树中，FZCL18与瓶囊碘泡虫形成姊妹群，由于本文使用的ITS-5.8S为洪湖碘泡虫特异性检测引物，可推测本文碘泡虫与洪湖碘泡虫更为接近。综上，鉴于优先命名的原则，将本文碘泡虫鉴定为洪湖碘泡虫。此外，本文所鉴定碘泡虫与寄生异育银鲫鳃部的瓶囊碘泡虫[13]相比，在形态上较短、较宽，2个极囊大小略有差异且极丝圈数少于瓶囊碘泡虫的9～10圈，在分子序列信息上，依据18SrDNA构建的系统发育树中，瓶囊碘泡虫没有与洪湖碘泡虫聚为一支，二者ITS-5.8S基因序列差异较大，再结合本文碘泡虫与瓶囊碘泡虫的寄生部位不同，可区分本文碘泡虫与瓶囊碘泡虫。

洪湖碘泡虫多寄生于湖北、江苏等地区池养异育银鲫上，引起诸如“喉孢子虫病”的大规模碘泡虫病害[10-11]，也有寄生在河南地区和吉林地区养殖异育银鲫的报道[2，14]，可见洪湖碘泡虫会对异育银鲫的养殖造成严重损失。笔者发现洪湖碘泡虫除了危害异育银鲫外，也可寄生于金鱼，当感染严重时亦可阻塞咽部或使咽部穿孔，危害金鱼养殖。异育银鲫是以方正银鲫为母本与兴国红鲤为父本经人工授精所产生的子代，在遗传进化关系上，大部分学者认为银鲫起源于鲫[15]，故异育银鲫属于比鲫起源分化还晚的类群，以往报道洪湖碘泡虫仅寄生于异育银鲫，而异育银鲫因和鲫的生境和食性相似，在养殖过程中可能存在混养，本文发现洪湖碘泡虫可寄生金鱼(鲫)，或可说明洪湖碘泡虫可寄生有限种的鲫属鱼类。此外，本文金鱼咽寄生碘泡虫18SrDNA与异育银鲫的咽寄生碘泡虫对应序列存在较多差异位点，可能与同一碘泡虫与不同宿主经历协同进化的自然历史过程有关，尚需更多种群序列信息，有待进一步研究。