近年来，我国小龙虾养殖业发展迅猛，2018年总产量达163.87万吨，养殖总面积达1680万亩。小龙虾病害的发生也越来越频繁，白斑综合征(white spot syndrome，WSS)是对虾的严重传染性疫病，自1992年暴发以来，已在世界范围内传播开来，每年给对虾养殖业造成巨大经济损失。白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)的宿主范围非常广泛，可感染40多种对虾和非对虾甲壳动物以及水生浮游动物，并表现出不同程度的感染性，这种广泛的宿主范围被认为是WSSV难以控制并大面积传播的主要原因。

本研究在2018－2019年，从江苏省泗洪县不同乡镇共采集76个外观正常、无发病症状的小龙虾样本，每个样本150只，通过PCR检测白斑综合征病毒，为淡水甲壳动物养殖生产中WSSV的诊断与检测及其流行研究提供科学依据。

一、材料与方法

1.小龙虾 实验用小龙虾来自泗洪县石集乡、龙集镇、临淮镇、青阳街道不同养殖塘口，平均规格10克/只，每个塘口采集小龙虾数量不低于150只，把小龙虾的鳃剪下研磨后存于酒精中，放于-20℃下保存，具体采集情况见表1。

表1 小龙虾采集时间、地点

2.主要试剂 Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒、核酸染料购自生工生物工程(上海)股份有限公司，用于PCR扩增的PremixTaq酶、DL2000DNAMarker购自TaKaRa，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

3.主要仪器 各种规格移液器选用艾本德公司产品，LG16-W高速离心机为北京京立离心机有限公司产品，S1000ThermalCyclerPCR仪为美国BIO-RAD公司产品，INFINITY-3026凝胶成像仪为法国VILBERLOURMAT公司产品，BG-Power600电泳仪为北京百晶生物技术有限公司产品。

4.WSSV的PCR检测 吸取0.5毫升用无水酒精保存的虾鳃，12000转/分离心3分钟，倒去酒精，加入1毫升生理盐水反复吹打，12000转/分离心3分钟，倒去生理盐水，底部为待检测的鳃样品，按照试剂盒操作步骤提取DNA。PCR反应体系为50微升，包括PremixTaq酶25微升、DNA模板5微升、引物(F1)1微升、引物(R1)1微升、去离子水18微升(以上都在冰上操作)；引物为F1:5'-ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG-3'，R1:5'-TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA-3'。PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，30个循环，72℃延伸10分钟，4℃保温，扩增1447bp片段。PCR产物加入1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，结果在凝胶成像系统中观察并拍照。

二、结果与分析

2018年5月22日共采集小龙虾样本23个，阳性检出数量20个，阳性检出率为87%；2018年7月25日共采集小龙虾样本11个，阳性检出数量4个，阳性检出率为36.4%；2019年3月28日、4月6日共采集小龙虾样本21个，阳性检出率为0；2019年5月14日共采集小龙虾样本21个，阳性检出数量17个，阳性检出率为81%，具体实验结果见图1～4(M为DNAMarker)。

三、讨论

从实验结果可以看出，外观正常、无症状的小龙虾也会携带白斑综合征病毒，且阳性检出率和温度有一定的关系。在3、4月水温14～15℃、7月水温30℃时，病毒的阳性检出率较低，甚至为零；当水温在20℃左右时，病毒的阳性检出率较高，达到80%以上。

图1 2018年5月22日样本PCR电泳图谱

图2 2018年7月25日样本PCR电泳图谱

图3 2019年3月28日、4月6日样本PCR电泳图谱

图4 2019年5月14日样本PCR电泳图谱

白斑综合征为季节性发病，华东地区发病季节在5月初至7月初，这就是很多养殖户说的小龙虾“五月瘟”。在水温20℃左右时，白斑综合征病毒在小龙虾体内的携带率比较高，所以我们在养殖过程中应注重提高小龙虾的体质，改善养殖环境，要在小龙虾携带病毒的前提下仍然能够健康生长，可从以下几个方面控制。

1.放苗时间尽量控制在4月25日之前 5月以后小龙虾白斑综合征病毒带毒率高，虾苗在回捕和运输过程中易缺氧、受伤，投放到塘口易发生应激反应，在这种条件下病毒会大量增殖，如果选在5月放苗，虾苗更容易发生死亡。

2.放养密度不宜过大 放养密度过大，排泄物、残饵过多，水质底质恶化，溶解氧不足，小龙虾体质下降，抗病能力减弱。

3.改善水体环境 养护好水草，定期使用微生物制剂如乳酸菌、EM菌等，调节池塘生态环境。

4.投喂高蛋白质的优质配合饲料 优质配合饲料可以提高小龙虾的抗病能力。

5.进地笼的小龙虾全部捕出 在起捕上市的过程中，所有进地笼的小龙虾无论大小全部捕出，不要回塘。小龙虾在地笼袋口处比较拥挤，容易引发缺氧和受伤，体质下降，病毒易增殖，加之小龙虾领地意识强，回塘的小规格虾容易受到留塘虾的攻击，导致白斑综合征病毒扩散。