大蒜素在鲤、鲫血浆中的药物代谢动力学研究

潘浩1,2，王荻1，卢彤岩1

(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,哈尔滨150070;2.上海海洋大学水产与生命学院,上海201306)

摘要：建立鲤(Cyprinus carpio specularis)、鲫(Carassius auratus)血浆中大蒜素含量的气相色谱检测方法,并研究大蒜素在鲤、鲫体内的药物代谢动力学特征。对鲤、鲫以7.5 mg/kg的剂量单次口灌大蒜素，于停药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24、36、48、72 h采集血浆，采用气相色谱法(GC)检测药物含量，通过DAS3.0软件分析药动学参数。结果显示：二烯丙基二硫醚(DADS)和二烯丙基三硫醚(DATS)的最低检测限均为10 ng/mL ，DADS、DATS在鲤血浆中的平均回收率分别为77.05%～97.98%、73.39%～108.51%，在鲫血浆中的平均回收率分别为87.05%～ 95.68%、83.69%～102.75%。药物的两种主要成分在健康鲤鲫体内吸收较完全，分布广泛，DADS较DATS吸收快，消除慢。

关键词：鲤(Cyprinus carpio specularis);鲫(Carassius auratus)气相色谱法；大蒜素；药物代谢动力学

大蒜素(garlicin)，化学名为二烯丙基三硫化物，是大蒜的主要有效成分，有刺鼻气味，微溶于水，溶于乙醇、苯、乙醚等有机溶剂[1]。大蒜素性质不稳定，常温下极易挥发，可进一步分解生成性质稳定的二烯丙基二硫化物(DADS) 、二烯丙基硫化物(DAS) 、阿霍烯(ajoene) 及少量的二烯丙基硫化合物(DATS)等[2]。大蒜素抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌都具有较好的抑制作用[3]，对有益菌则无抑制作用，而且大蒜素无毒副作用，不会产生药物残留，不会导致细菌产生耐药性，是抗生素的首选替代药物[4]。

目前，对大蒜素在水产养殖中作为添加剂的研究己经做了大量的工作。有研究表明，饲料中添加适量大蒜素可显著提升鱼的摄食量与生长速度[5-9]。有关大蒜素抗菌作用也有诸多报道，李婵等[10]在虹鳟饲料中添加15 mg/kg的大蒜素,结果表明大蒜素显著提高了肾脏中碱性磷酸酶的活力；时威等[4]的研究表明，大蒜素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌作用；宋文华等[11]对草鱼的研究表明饲料中添加0.4%、0.8%大蒜素组的草鱼血清超氧化物岐化酶活性高于对照组。但尚未见关于大蒜素在鱼体内的药代动力学研究报道，本实验就此进行研究，通过计算有关的药动学参数，为制定大蒜素在鲤、鲫养殖病害防治中的科学、合理给药方案提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验动物

1.1.1试验鱼

鲤(Cyprinuscarpiospecularis)(1.3±0.2)kg、鲫(Carassiusauratus)(0.7±0.2)kg，由黑龙江水产研究所呼兰冷水性鱼类试验站提供；试验在自动循环水族缸中进行，每缸两尾试验鱼，试验期间持续给氧。试验鱼暂养3 d，期间正常饲喂全价基础饲料。给药前停饲24 h，试验期间不投喂，水温保持在(20±0.5)℃，持续给氧，保持溶氧浓度大于6.00 mg/L。

1.1.2药品与试剂

DADS标准品：含量94.2%，中国食品药品检定研究院，批号：100384-201403；DATS标准品：75%，上海安普CNW，货号：CFEQ-4-440081-0005。二氯甲烷(A.R)；正己烷(GC),大蒜油，含量98%，北京渔经生物技术有限责任公司。

1.1.3试验仪器

安捷伦7890B气相色谱仪，Agilent仪器公司；3K15离心机，Sigma公司；FJ200-S调速混匀器，上海标准模型厂；SB5002电子天平，上表电子仪器厂；MD200-2氮吹仪，杭州奥盛仪器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1给药剂量及血浆采集

以7.5 mg/kg体质量的给药剂量对鲤、鲫单次口灌大蒜素油溶液(18.75 μL大蒜油溶于10 mL植物油)，各18尾鱼，随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，每组6尾鱼。单次口灌大蒜素后，采用活体多次体侧取血法[12]，各剂量组取样方案为，Ⅰ组分别于给药后 0.25、1、4、12、48 h，Ⅱ组于 0.5、1.5、6、24、72 h，Ⅲ组于 0.75、2、8、36 h 在试验鱼尾部采集血液1 mL(注射器事先用3‰肝素钠润洗)，每次采样前后均用 75%酒精棉球于进针部位进行消毒，并在采样后按压针孔部位以止血。血液样品4 000 r/min离心10 min后，取上层血浆置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2血浆样品处理

从-20 ℃冰箱中取出血浆样品，于冰上自然解冻后摇匀，取0.5 mL血浆，加0.5 mL正己烷涡旋0.5 min，3 000 r/min离心5 min，过0.22 μm有机滤膜上机待测。

1.2.3气相色谱条件

色谱柱:Agilent 7890B HP-5柱(30 m×320 μm×0.25 μm)；柱温：50 ℃(25 ℃/min)升至150℃，保持2 min,(30 ℃/min)升至240 ℃，保持1 min；检测器：火焰光度检测器FPD(S)；检测器温度：200 ℃，空气流量：60 mL/min，氢气燃气流量：60 mL/min，尾吹气流量：60 mL/min；进样量：1 μL，不分流进样；进样口温度：160 ℃；燃气：氢气，纯度≥99.999%；助燃气：空气；载气：高纯氮气，恒流模式，2 mL/min。

1.2.4标准曲线的绘制

用正己烷将DATS、DADS标准品稀释成浓度为25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 ng/mL的混合标准工作液，精确吸取1 μL注入气相色谱仪，以检测峰面积为纵坐标，大蒜素质量浓度为横坐标绘制标准曲线，分别求出DADS、DATS的回归方程和相关系数。

1.2.5回收率测定

取空白血浆0.5 mL，添加100、500、1 000 μg/L的混合标准液，添加标准液的总体积为1 mL，设三个平行组，混匀静置一段时间后，使药物充分渗入组织中，按照样品前处理的方法处理后，进行测定。按照公式进行计算：

回收率=实测药物浓度/实际药物浓度×100%

1.2.6精密度测定

在1 d内分别重复测定上述6个浓度梯度的同一样品3次，在一周内重复测定3次，计算出样品在不同浓度梯度下的相对标准偏差，计算出日内和日间精密度。

1.2.7数据处理

标准曲线由气象色谱检测报告所得，药-时曲线采用Microsoft Excel软件绘制；药动学模型拟合及参数计算使用DAS3.0软件处理。

2结果

2.1标准曲线及其检测限

应用本试验建立的气相色谱检测方法，DADS和DATS的最低检测限均为10 ng/mL。以标准溶液质量浓度为横坐标x，以峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线如图1、图2所示。回归方程分别为：

y=9.112 74e-2x2+3.764 00x-802.576 7，r=0.999 25；

y=6.646 68e-2x2-3.379 01x+64.551 61，r=0.999 19。

图1　DADS标准曲线

图2　DATS标准曲线

2.2标准品与样品色谱图

在本试验条件下,DADS的出峰时间在3.7 min左右,DATS的出峰时间在5.2 min左右。与标准品色谱图对比可以发现,两者的色谱峰和出峰时间一致。

2.3回收率与精密度

本试验条件下，混合标准液在鲤血浆的回收率分别为91%～97%，在鲫血浆的回收率为73%～100%。日内精密度分别为0.38%±0.053%和0.40%±0.060%，日间精密度分别为0.28%±0.069%和0.45%±0.077%。

2.4大蒜素在鲤、鲫体内的药时曲线与主要药动学参数

DADS、DATS在鲤、鲫血浆中药动学特征均符合一级吸收二室开放模型，其代谢方程分别为：C=27.02e-0.14t+0.001e-0.05t-27.021e-27.02t、C=26.72e-0.23t+0.001e-0.002 5t-26.721e-173.87t、C=26.04e-0.57t+18.3e-0.23t-44.34e-44.34t、C=7.07e-0.61t+12.18e-0.11t-19.25e-19.25t。

主要药物代谢动力学参数如表1，药时数据如表2。图 3、4 显示的是在(20±0.5)℃时以7.5 mg/kg体质量药量给鲤、鲫单剂量口灌大蒜素后，药物在鲤、鲫血浆的浓度随时间变化的规律。

表1　DADS和DATS在鲤、鲫血浆中的药代动力学参数

注:B.消除相的零时截距；β.消除速率常数；A.分布相的零时截距；α.分布速率常数； ka.药物吸收速率常数； TL.延滞时间； T1/2β.消除相半衰期；T1/2α.分布相半衰期； T1/2ka.吸收相半衰期； K21.药物自周边室到中央室的一级转运速率； K12.药物自中央室到周边室的一级转运速率；K10.药物自中央室的消除速率； AUC.药时曲线下总面积； CL(s).体积内总消除率；Cmax.峰浓度； Tmax.达峰时间； V/F(c).表观分布容积。

表2　DADS和DATS在鲤、鲫血浆中的浓度

图3　DADS、DATS在鲤鱼血浆中的浓度

图4　DADS、DATS在鲫鱼血浆中的浓度

3讨论

气相色谱法是近年兴起的一种新型、高效的色谱技术，适宜于检测易于挥发但不会发生分解的化合物。气相色谱的典型用途包括测试某一特定化合物的纯度以及对混合物中的各组分进行分离鉴定(同时还可以测定各组分的相对含量)。在某些情况下，气相色谱还可能对化合物的表征有所帮助。大蒜素的两种主要有效成分DADS、DATS性质相对稳定但极易挥发，因而气相色谱法可以在其挥发的同时较为完全地测定其含量。

由药-时曲线可以看出，DADS在鲤、鲫的血浆组织中均有双峰出现，魏凤环等[20]研究表明:双峰乃至多峰现象出现的机制被认为可能是肠-肝循环(即药物经胆汁或部分药物经胆汁排入肠道，在肠道中药物成分又重新被吸收，经门静脉又返回肝脏的现象)和胃肠道的多部位吸收(胃肠道不同部位有多个不同的吸收位点，由于不同位点的腔道内膜对药物的通透性不同，故口服后不同部位对药物的吸收时间和吸收速率并不一致，使被吸收的药物在血液中叠加)，而肠-肝循环又被认为是药-时曲线产生双峰或者多峰现象最有可能的一种机制，如果存在肠-肝循环，则第二峰的浓度要低于第一峰[21-22]。本试验中，DADS在鲫的血浆组织内的第二峰浓度远高于第一峰，明显不符合肠-肝循环的特征；DADS在鲤血浆中第二峰浓度高于第一峰，推测第二峰浓度较高的原因可能与药物于某一时间点的集中转运、排泄以及肾小管的重吸收有关。因此， DADS在鲤鲫血浆中出现双峰现象的机制并不是为肠-肝循环，推测本试验中大蒜素在鲤、鲫血浆中的药物代谢动力学与其它常规药物不同，其吸收分布机制有待进一步研究。

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