硫酸铜治疗卵形鲳鲹淀粉卵涡鞭虫病的研究

李志成，江 飚，钟志鸿，李诗钰，何润真，唐嘉嘉，李安兴

（1.中山大学生命科学学院/广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东 广州 510275；2.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东 广州 510225）

眼点淀粉卵涡鞭虫 (Amyloodinium ocellatum) 隶属于肉鞭动物门、植鞭纲、腰鞭目、胚乳科、淀粉卵涡鞭虫属，是一种寄生鞭毛虫，通常寄生于热带、亚热带海水鱼类的鳃、皮肤和鳍条等处[1-2]。其生活史包括涡孢子、营养体、包囊3个阶段，环境适宜时可在1周内完成1个生活史周期[3-6]。大量眼点淀粉卵涡鞭虫寄生于鱼体可引起严重的淀粉卵涡鞭虫病，该病具有爆发速度快、危害大等特点，可导致海水养殖鱼类大量死亡，造成严重的经济损失[7-10]。

卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus) 是我国南方重要的海水鱼养殖品种，具有生长速度快、饲料转化率高、肉质鲜美等特点[11-13]。然而，随着高密度养殖的发展，养殖环境逐渐恶化，卵形鲳鲹病害频发，其中寄生虫病极为显著，给水产养殖业造成了巨大的损失[14-17]。常见感染卵形鲳鲹的寄生虫有刺激隐核虫 (Cryptocaryon irritans)、车轮虫(Trichodina) 和眼点淀粉卵涡鞭虫等[18]。卵形鲳鲹淀粉卵涡鞭虫病主要爆发于室内工厂化养殖或池塘养殖等养殖密度高、水体交换量小的养殖环境。

硫酸铜是水产养殖中常用药物，可用于杀灭原生动物病原如车轮虫、眼点淀粉卵涡鞭虫等[19-20]，其作用机理是铜离子与虫体的蛋白质结合，使蛋白质变性，达到杀灭虫体、防治鱼病的目的[21]。Virgula等[22]使用质量浓度为2、1 mg·L−1的硫酸铜溶液浸泡鱼体1、24 h均可有效治疗遮目鱼 (Chanos chanos) 淀粉卵涡鞭虫病，说明利用硫酸铜防治海水鱼类淀粉卵涡鞭虫病具有显著效果。然而，硫酸铜对水产动物具有较强的毒性，浓度过高会导致养殖鱼类中毒死亡，浓度太低对眼点淀粉卵涡鞭虫不具有毒杀作用[23]。目前，使用硫酸铜防治卵形鲳鲹淀粉卵涡鞭虫病的资料匮乏，特别是最低有效剂量和合理应用方法尚无资料。因此，研究科学合理地使用硫酸铜，减少其在杀虫过程中对鱼体及周围环境产生副作用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 眼点淀粉卵涡鞭虫收集和传代

从养殖过程中自然爆发淀粉卵涡鞭虫病的卵形鲳鲹鳃处分离并收集包囊，按照Bower和Biever[24]的方法以(3.35±0.25) g卵形鲳鲹幼鱼作为宿主，使用每尾鱼4 000～6 000涡孢子的亚致死剂量感染卵形鲳鲹。并于2 d后将感染鱼浸泡于淡水中，使营养体从鱼体脱落。将收集的包囊用灭菌海水冲洗数次后置于28 ℃恒温培养箱中孵化并收集涡孢子进行下一轮感染，建立本实验虫株的传代系统，以便随时获取足够数量的包囊和涡孢子用于实验。

1.2 卵形鲳鲹的养殖管理

实验所用的卵形鲳鲹 (3.35±0.25) g购于广东省深圳市大鹏新区某鱼排。实验鱼在容积为500 L的圆形塑料桶中暂养2周，每日早晚投喂商品饲料，日投喂量为鱼体质量的2%～3%。养殖用水为自然海水，盐度31～33，水温27.4～29.2 ℃，pH 8.0～8.5，溶解氧质量浓度＞6 mg·L−1，氨氮质量浓度 0.6～0.7 mg·L−1，流水养殖，每日吸污。

1.3 硫酸铜溶液对涡孢子的体外杀虫实验

根据Bower和Biever[24]的涡孢子计数方法，收集在9 h内孵化出的涡孢子，置于50 mL离心管中混匀，用移液枪吸取10份，每份2 μL虫液于细胞计数板计数，并计算涡孢子的密度，用灭菌海水稀释虫液用于后续实验。

配制质量浓度为200 mg·L−1的硫酸铜 (CuSO4) 原液。在96孔板中加入硫酸铜原液并进行梯度稀释，每孔加入100 μL (约200涡孢子) 虫液。最高浓度组的硫酸铜溶液质量浓度为 100 mg·L−1，最低浓度组为 0.012 5 mg·L−1。以灭菌海水作为对照组，每个浓度设置3个平行，室温下孵育，于第10、第30、第60和第120分钟观察涡孢子活力，涡孢子停止游动并沉于底部则判定为死亡，能引起涡孢子100%死亡的浓度即为有效质量浓度。

1.4 硫酸铜溶液对包囊的体外杀虫实验

收集从鱼体脱落的包囊，用灭菌海水反复冲洗数次以去除杂质，在96孔板中每孔加入20～30颗包囊。将质量浓度为200 mg·L−1的硫酸铜溶液进行梯度稀释，使最高浓度组的硫酸铜溶液为 100 mg·L−1，最低浓度组为 0.1 mg·L−1。以灭菌海水作为对照组，每个浓度设置3个平行，置于28 ℃恒温培养箱中培养。包囊在不同质量浓度的硫酸铜溶液中连续孵育并于第24、第48、第72和第96小时分别观察并统计包囊的分裂情况，计算包囊分裂率。

1.5 硫酸铜溶液对卵形鲳鲹幼鱼的急性毒性实验

为确定实验硫酸铜溶液有效质量浓度范围，在正式实验前先进行预实验，获得硫酸铜溶液对卵形鲳鲹96 h无死亡的最高质量浓度为100 mg·L−1；24 h内卵形鲳鲹100%死亡的最低质量浓度为300 mg·L−1。根据预实验结果，在此质量浓度范围内，以1.3间隔系数设置5个质量浓度梯度组，分别为300.00、230.77、177.51、136.55、105.04 mg·L−1，以自然海水为对照组，每组10尾鱼，设置2个平行。分别记录第24、第48、第72和第96小时每组鱼的死亡情况并及时清理死鱼，实验期间不投喂饲料。实验鱼死亡判断标准为：丧失游动能力，停止呼吸，沉于池底，触碰无反应。各时间点的半致死质量浓度 (LC50) 和安全质量浓度按照江飚等[25]的方法进行计算。

1.6 硫酸铜溶液对鱼体上营养体的驱除实验

分别配制质量浓度为4.0、2.0、1.0、0.5、0.4、0.3、0.2 mg·L−1的硫酸铜溶液100 L，以自然海水作为对照组。以每尾鱼8 000涡孢子的剂量人工感染卵形鲳鲹，感染36 h后将病鱼同时放入不同质量浓度的硫酸铜溶液中，每组40尾鱼。经硫酸铜溶液浸泡处理0、0.5、1、2、4、8 h后分别从每个实验组中随机捞取5尾鱼，取左侧第二片鳃在显微镜下观察，统计营养体数量。计算不同质量浓度硫酸铜浸泡不同时间对卵形鲳鲹的相对驱虫率。计算公式为：

式中D为相对驱虫率，N为卵形鲳鲹在硫酸铜溶液中浸泡前鳃丝上营养体数量，Nt为卵形鲳鲹在硫酸铜溶液中浸泡不同时间后鳃丝上营养体数量。

1.7 低浓度硫酸铜溶液连续药浴治疗实验

根据体外实验结果，分别用质量浓度为0.2、0.4 mg·L−1硫酸铜溶液连续药浴治疗卵形鲳鲹淀粉卵涡鞭虫病，以自然海水为对照组，每组10尾鱼。实验前以眼点淀粉卵涡鞭虫人工感染卵形鲳鲹，感染后24 h将病鱼分别放入100 L质量浓度为0.2、0.4 mg·L−1的硫酸铜溶液和100 L自然海水中静水养殖。每日记录各组鱼的死亡数，观察是否有发病症状，并及时捞出死鱼，共记录10 d，并在第10天从每组存活的鱼中随机捞取3尾，取鳃镜检，观察是否仍有眼点淀粉卵涡鞭虫寄生。

1.8 数据处理

采用SPSS 21.0和Excel 2016软件进行数据分析，通过DPS数据处理系统进行差异显著性分析，并使用Graph-Pad Prism 5软件作图。

2 结果

2.1 硫酸铜溶液对涡孢子杀灭作用

将涡孢子置于不同质量浓度的硫酸铜溶液中，统计不同时间点各质量浓度硫酸铜溶液中涡孢子存活情况。实验结果显示，硫酸铜对涡孢子具有很强的杀灭作用，在10、30、60、120 min药浴时间内杀死100%涡孢子的最低硫酸铜质量浓度分别为 3.13、0.78、0.20、0.20 mg·L−1(表1)。

表1 硫酸铜溶液对眼点淀粉卵涡鞭虫涡孢子的杀灭效果Table 1 Effect of copper sulfate solution on A.ocellatum dinospores

2.2 硫酸铜溶液对包囊的杀灭作用

将包囊置于不同质量浓度的硫酸铜溶液中连续药浴，分别在药浴24、48、72、96 h后进行观察。结果显示，包囊的发育过程受硫酸铜溶液影响不显著 (表2)，100.00 mg·L−1硫酸铜溶液组和对照组在连续浸泡24 h后均能正常分裂，两组包囊的最终分裂率分别为 (90.92±1.90) %和 (96.94±2.68) %。具有发育能力的包囊在24 h内已完成发育，各处理组包囊在第48、第72、第96小时的分裂率均与第24小时的分裂率相同。

表2 硫酸铜溶液对眼点淀粉卵涡鞭虫包囊分裂率的影响Table 2 Effect of copper sulfate solution on A.ocellatum tomonts cleavage rate %

2.3 硫酸铜溶液对卵形鲳鲹幼鱼的安全剂量

根据预实验结果，以1.3间隔系数设置5个实验组，硫酸铜溶液质量浓度分别为300.00、230.77、177.51、136.55和105.04 mg·L−1。结果显示，当硫酸铜溶液质量浓度为300.00 mg·L−1时，实验鱼12 h内出现体色发黑、头朝上斜游、体表黏液增多等中毒症状，在24 h内全部死亡，表明该浓度硫酸铜是卵形鲳鲹的中毒剂量，其余浓度均出现不同程度的死亡，而对照组在96 h内未出现死亡 (表3)。计算可知，硫酸铜对卵形鲳鲹幼鱼第24、第48、第72和第96小时的LC50分别为202.57、180.59、173.78和173.78 mg·L−1；安全质量浓度小于 43.06 mg·L−1。

表3 卵形鲳鲹幼鱼对硫酸铜溶液的耐受力Table 3 Tolerance of juvenile T.ovatus to copper sulfate solution

2.4 硫酸铜溶液对鱼体营养体的驱除效果

将人工感染眼点淀粉卵涡鞭虫的卵形鲳鲹幼鱼浸泡于不同质量浓度的硫酸铜溶液中，在不同时间点从每个实验组中随机捞取5尾，统计左侧第二片鳃上营养体数量。结果显示，眼点淀粉卵涡鞭虫营养体对硫酸铜敏感 (表4)，最低有效驱虫质量浓度为 0.4 mg·L−1，在 0.4 mg·L−1硫酸铜溶液中药浴8 h可使99%以上的营养体从鱼体脱落；在1.0 mg·L−1硫酸铜中药浴 4 h (图1)，2.0 mg·L−1硫酸铜中药浴2 h均可100%驱除鱼体上的营养体。

表4 不同质量浓度硫酸铜浸泡不同时间的相对驱虫率Table 4 Relative deworming rate of different mass concentrations of copper sulfate immerse for different time

图1 寄生在病鱼鳃处的眼点淀粉卵涡鞭虫营养体显微镜观察a.感染鱼鳃上营养体寄生情况；b.感染鱼经1 mg·L−1硫酸铜溶液浸泡1 h后鳃上营养体寄生情况；c.感染鱼经1 mg·L−1硫酸铜溶液浸泡4 h后鳃上营养体寄生情况Figure 1 Microscopic observation of trophonts on gill of infection fisha.Parasitism of trophonts on the gill of infected fish; b.Parasitism of trophonts on the gills of infected fish after being immersed in 1 mg·L−1 copper sulfate solution for 1 h; c.Parasitism of trophonts on the gills of infected fish after being immersed in 1 mg·L−1 copper sulfate solution for 4 h

2.5 低浓度硫酸铜溶液连续药浴治疗效果

将人工感染眼点淀粉卵涡鞭虫的卵形鲳鲹幼鱼分别在0.2、0.4 mg·L−12个低质量浓度硫酸铜溶液和自然海水中连续药浴10 d (图2)。结果显示，对照组卵形鲳鲹在第2天出现死亡，并在第2、第3天连续死亡，在第3天死亡率达100%。0.2、0.4 mg·L−1硫酸铜溶液连续药浴组卵形鲳鲹仅在第2、第3天出现死亡，死亡率分别为20%和10%，之后状态稳定未见患病症状，第10天取鳃观察未发现虫体。

图2 不同处理组卵形鲳鲹的死亡率Figure 2 Mortality of T.ovatus in different groups

3 讨论

水产养殖中，硫酸铜因成本低、有效性高等特点常被用于治疗鱼类真菌和寄生虫性疾病且疗效显著[23]。研究表明，用100 mg·L−1的五水硫酸铜溶液处理斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus) 鱼卵能有效控制水霉病且不会影响孵化率[26]；将患病鱼在质量浓度为1.5 mg·L−1的硫酸铜溶液中药浴2 h，间隔1 d再以同剂量硫酸铜溶液药浴1次，可有效治疗梭鲈 (Sander lucioperca) 幼鱼的车轮虫病[27]；硫酸铜能有效治疗养殖鱼类淀粉卵涡鞭虫病[22]。但是使用硫酸铜治疗养殖鱼类淀粉卵涡鞭虫病的最低有效剂量和合理应用方法尚未见报道。因此，优化硫酸铜的使用浓度、最大程度地降低硫酸铜在使用过程中的毒性、提高治疗效率并建立有效的方案来控制养殖鱼类淀粉卵涡鞭虫病具有重要意义。

本研究结果表明，眼点淀粉卵涡鞭虫的涡孢子和营养体对硫酸铜敏感性强。用3.13、0.78、0.20 mg·L−1硫酸铜溶液分别药浴处理10、30、60 min均可100%杀灭涡孢子；以2.0、1.0、0.5 mg·L−1硫酸铜溶液分别药浴患病卵形鲳鲹幼鱼2、4、8 h均可使营养体完全脱落，幼鱼患病症状消失，恢复正常。但在实验中发现，眼点淀粉卵涡鞭虫包囊对硫酸铜的耐受性强，在100 mg·L−1硫酸铜中连续药浴仍能继续分裂，这与Paperna[28]报道的10 mg·L−1硫酸铜药浴处理不能有效阻止包囊分裂的结果一致。包囊耐受性强可能是导致淀粉卵涡鞭虫病难以根治的主要原因[29]。徐绍刚等[21]在治疗漠斑牙鲆 (Paralichthys lethostigma) 淀粉卵涡鞭虫病时发现将病鱼用淡水浸泡处理后鱼体恢复正常，开始摄食，但几天后又重复感染，且较上一次更加严重。硫酸铜在杀灭涡孢子和驱除鱼体营养体方面效果显著，但由于水体中过量的铜离子对养殖鱼类及周围环境具有很强的毒副作用，因此生产上不能为了治疗淀粉卵涡鞭虫病而盲目增加硫酸铜的使用剂量。

铜 (Cu) 元素参与鱼体超氧化物歧化酶、细胞色素氧化酶、糖蛋白、血红蛋白等物质合成过程，是鱼类生长和代谢必不可少的微量元素[30-31]。然而，水环境中铜离子浓度过高，会通过促进对细胞和生物体有毒的自由基的产生来破坏生物体正常的代谢功能，对水生生物具有致死性[23]。因此，科学使用硫酸铜、掌握淀粉卵涡鞭虫生活史各个时期对硫酸铜溶液的敏感性，并在合适的时期利用最低有效浓度的硫酸铜溶液杀灭眼点淀粉卵涡鞭虫具有重要意义。在使用硫酸铜治疗鱼类真菌和寄生虫性疾病之前需要清楚水体中的铜离子对治疗鱼类的安全浓度。然而，水体中铜离子浓度受水质特性的影响，尤其是温度、pH、碱度、硬度和盐度等，因此硫酸铜用量需根据水环境的具体情况而定[32-34]。硫酸铜对各水产动物的安全浓度存在差异，研究表明体质量为 (8.6±0.3) g的斜带石斑鱼 (Epinephelus coioides)对硫酸铜的安全质量质量浓度为1.485 mg·L−1[35]；全长3～4 cm的斑石鲷 (Oplegnathus punctatus) 幼鱼对硫酸铜的安全质量浓度为 2.22 mg·L−1[36]。本实验中体质量为 (3.35±0.25) g 的卵形鲳鲹幼鱼对硫酸铜的安全质量浓度为43.06 mg·L−1，耐受性强，远高于可有效杀灭自由游动的眼点淀粉卵涡鞭虫涡孢子的质量浓度。表明在有效的杀虫浓度范围内，硫酸铜对卵形鲳鲹的毒性较小，不会引起中毒或死亡。

眼点淀粉卵涡鞭虫是一种常见的鱼类寄生虫，对宿主没有选择特异性，几乎可以感染生活环境下的所有鱼类，具有环境适应性强、发病速度快等特点，已被列入重要的海洋鱼类病原[37-41]。消灭可在水中自由游动的涡孢子或使用药物使营养体从鱼体脱落并大量换水，清除水体中的包囊，是目前防治淀粉卵涡鞭虫病的重要策略。本研究根据硫酸铜体外杀灭包囊和涡孢子的实验结果，创新性地将感染鱼连续浸泡在质量浓度为0.2、0.4 mg·L−1的硫酸铜溶液中，10 d后卵形鲳鲹幼鱼未见患病症状，有明显的疗效，说明涡孢子从包囊中孵化后迅速被硫酸铜杀灭而未感染鱼体。

综上，卵形鲳鲹对硫酸铜的耐受性强，在有效杀虫浓度范围内不会造成幼鱼死亡。眼点淀粉卵涡鞭虫在营养体和涡孢子阶段对硫酸铜敏感，但发育形成包囊后对硫酸铜具有抗性，难以杀灭。故生产上可通过高质量浓度 (2.0 mg·L−1) 硫酸铜溶液短时间 (2 h) 药浴使营养体从鱼体脱落，再使用低质量浓度 (0.2 mg·L−1) 硫酸铜溶液连续药浴(10 d) 杀灭刚孵化的涡孢子，可有效治疗卵形鲳鲹淀粉卵涡鞭虫病。