罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)又名马来西亚大虾、淡水长臂大虾，是许多亚洲国家和地区重要的水产经济虾类。在我国，罗氏沼虾最初由中国农业科学院引进试养[1]，因其具有生长速度快、抗病力强、口感好、个头大、耐运输、国内外市场需求量大等优点，现已在各地广泛养殖。上海位处长江口，具备优质的咸淡水资源，适合多种虾、蟹的繁殖和增养殖。上海市奉贤区水产技术推广站于1987年便开展了罗氏沼虾养殖试验并取得成功[2]。随后，金山区也开展了罗氏沼虾虾苗繁育技术研究，之后逐步发展壮大，现已是我国长三角地区罗氏沼虾亲虾及虾苗的重要供应基地之一。

近年来，病毒性疾病对水产养殖业发展的影响很大，已造成许多重大经济损失，对虾类健康养殖的威胁程度也日趋严重。现已发现多种侵染罗氏沼虾的病毒，如双顺反子病毒、诺达病毒、虹彩病毒、黄头病毒、肝胰腺细小病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒等[3-5]。其中，虹彩病毒是一种胞浆型的双链DNA病毒。目前国际病毒分类委员会将虹彩病毒科细分为6个属：蛙病毒属(Ranavirus)、淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)、肿大细胞虹彩病毒属(Megalocytivirus)、绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)、虹彩病毒属(Iridovirus)和十足目虹彩病毒属(Decapodiridovirus)。十足目虹彩病毒是近年发现的一个新属，感染罗氏沼虾的虹彩病毒(DIV1)即为该属成员。

罗氏沼虾“白点病”最初发现于我国广东珠三角养殖区，随后在福建漳州养殖区也有零星出现，近两年在江都、高邮、兴化等江苏的主养地呈暴发态势，危害严重。近年来，在上海郊区养殖的罗氏沼虾也出现了头部“白点病”，造成大量沼虾死亡。通过对上海地区患“白点病”罗氏沼虾的组织病理及超微病理进行分析，并对其病原进行分子鉴定，确定该病为虹彩病毒(DIV1)导致。本研究首次在上海养殖区发现此病，应当引起养殖户关注，加强防范，避免造成较大的经济损失。

1 材料和方法

1.1 样品来源及前处理

罗氏沼虾病虾样本采集于上海市奉贤区某水产养殖场。养殖池为大棚覆盖的淡水池塘，水温为17～20 ℃。切取病虾的造血组织和健康虾的造血组织，各分成3份：一部分放入预装有戴维森氏AFA(Davidson’s AFA)固定液的样品瓶中，常温固定24 h；另一部分再细切成体积大小为1～2 mm3的组织块后放入预装有2.5%戊二醛固定液的离心管中，4 ℃固定24 h；剩余部分放入预装有无水乙醇的离心管中，常温保存。以上述3种方式处理的组织分别用于组织病理、超微病理和分子检测。

1.2 普通组织病理检查

按常规的石蜡组织切片程序处理用Davidson’s AFA液固定的组织块。组织块经脱水、透明、包埋、切片、脱蜡、复水后，使用苏木精和伊红(H&E)对切片进行染色，Leica DM4B 显微镜成像及分析。

1.3 超微组织病理检查

将2.5%戊二醛固定液固定的小组织块用0.1 M磷酸盐(PBS)缓冲液(pH=7.2)清洗，并在1% OsO4(锇酸)中后固定2 h，再次漂洗组织，并经梯度乙醇逐级脱水。脱水后，将样品包埋在环氧树脂812中，60 ℃聚合48 h。用徕卡超薄切片机切片，厚度为60～70 nm，铜网收片，乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。最后使用FEI Tecnai G2 Spirit透射电子显微镜观察细胞病理变化。

1.4 总DNA提取

将乙醇固定的样品组织用超纯水漂洗3次，去掉残留乙醇后，按照天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的说明进行操作。所有DNA样品用TE缓冲液洗脱，并于-20 ℃保存备用。

1.5 病毒基因检测

参考全国水产技术推广总站推荐的PCR方法——《虾虹彩病毒病诊断规程》(SC/T 7237—2020)。引物DIV1-F1(5’-GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT-3’)和DIV1-R1(5’-TCGTTTCGGTACGAAGATGTA-3’)用于扩增虹彩病毒(DIV1)的ATP酶基因，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR扩增25 μL体系：PremixTaq酶12.5 μL，正、反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，灭菌双蒸水9.5 μL。PCR反应条件：95 ℃初始变性3 min；然后95 ℃变性30 s、59 ℃退火30 s和72 ℃ 延伸30 s，共35 个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，于紫外光源下观察分析。取阳性PCR产物5 μL送测序，所得核酸序列经修剪头尾的不可靠碱基后，输入美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库进行BLAST检索比对，确定病原序列是否与目标病原一致。

2 结果

2.1 病虾的临床症状

在养殖过程中发现，罗氏沼虾突然停止进食，很少在水面游动。停饲后2～10 d，死亡率可达100%。尤其使用氯类制剂对发病塘进行水体消毒后会导致沼虾死亡加剧。病虾大多“偷死”在池塘的深水区，少数匍匐在池边浅水处，活力明显减弱，反应迟缓，濒死个体失去游动能力。病虾体略微发红，空肠、空胃，体表明显症状是额剑基部的造血组织颜色变白(见图1)，因此被养殖户称为“白头病”或“白点病”。无论是单养罗氏沼虾的池塘，还是与南美白对虾或日本沼虾混养的池塘，均有“白点病”发生。此病具有传染性，呈现区域性发病的特点，通常1口塘发病后，周围几口养殖塘甚至区域内其他养殖户的养殖塘也会陆续发病。

图1 自然发病罗氏沼虾的头部白点症状

2.2 组织病理

组织病理检查显示，病虾造血组织出现了明显的病理变化：组织液增多和大量细胞坏死(见图2-a)，部分区域呈现局灶性坏死(见图2-b)。坏死细胞的细胞质中出现异常的嗜碱性包涵体，其细胞核呈现固缩现象(图2-c～d)，细胞失去原有的结构特征。

a.被感染的造血组织含有大量坏死细胞；b.造血组织的局灶性坏死；c.造血细胞的变性和坏死，白色箭头示坏死细胞中的核固缩，黑色箭头示嗜碱性包涵体；d.健康的造血组织，白色箭头示正常的细胞核。图2 患病罗氏沼虾造血组织的病理变化

2.3 超微病理

超薄切片透射电镜结果显示，病虾的造血组织中出现大量虹彩病毒，部分区域的病毒颗粒聚集，呈晶格状排列，多数病毒颗粒呈分散状分布在组织细胞中。造血细胞的细胞质中及细胞外基质中均可观察到病毒粒子，在细胞核中未发现病毒粒子。成熟病毒粒子由正六边形的衣壳和近似圆形的核心两部分构成，衣壳电子密度较低，核心的电子密度较高。病毒颗粒整体呈二十面体对称结构，直径为(153±8)nm，其核心直径为(91±5)nm。未成熟的病毒粒子仅有衣壳而无核心结构，呈空心状(见图3)。

a.大量虹彩病毒颗粒分布在造血组织中，N表示细胞核；b.*表示造血细胞内的虹彩病毒复制和组装区域；c.释放到细胞外基质中虹彩病毒颗粒；d.成熟的虹彩病毒颗粒具有近似正六边形的衣壳和电子致密的核心。图3 患病罗氏沼虾造血组织的超微病理变化

2.4 分子检测

凝胶电泳结果显示，病虾样品均扩增出与阳性对照大小一致的目标片段(见图4)，而健康沼虾无目的条带。BLAST检索结果表明，所有阳性片段测序获得的基因序列与虹彩病毒(Genbank No.KY681040)序列一致性均达99%以上，因此确定该病毒为十足目虹彩病毒DIV1。

注：M表示DNA maker，条带自上而下大小依次为2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、200 bp。1～7为患病罗氏沼虾，阴性对照为健康罗氏沼虾，空白对照所用模板为水，阳性对照为黄海水产研究所提供的阳性核酸。图4 患病罗氏沼虾虹彩病毒的PCR检测

3 讨论

3.1 造血组织变白是现场诊断DIV1感染的重要依据

病原体突破宿主免疫防线，侵入特定组织或器官进行大量增殖，并严重破坏机体正常的细胞组织结构和功能，从而导致靶组织、器官或机体表现出明显的异常信号，这些临床上肉眼可见的症状信号是病因诊断的重要依据。本研究通过电镜观察发现，DIV1具有虹彩病毒典型的二十面体结构，其主要侵染罗氏沼虾造血细胞的细胞质，未发现细胞核被感染的情况。DIV1在细胞质中大量增殖，并形成了较为透明的病毒发生基质，即H&E组织病理切片中被异常染色的包涵体结构，这与Qiu等[6]观察到的病理结果相似。此外，组织病理还发现，由于大量感染DIV1，因此病虾造血组织中出现大量的组织液及局部坏死病灶，这很可能是造血组织在临床症状上呈现不透明白色的原因。而且，据现有的虾类疾病研究报道，此症状为DIV1感染罗氏沼虾所特有，其他病原感染尚未发现此现象[7-9]。因此，水产兽医或养殖户在塘口进行疾病诊断时，可利用这一特点进行初诊。

3.2 虹彩病毒的流行及危害

DIV1易感宿主范围广泛，主要集中在十足目的虾类，包括罗氏沼虾、凡纳滨对虾、斑节对虾、脊尾白虾、日本沼虾、红螯螯虾和克氏原螯虾等[6]。有研究证实，三疣梭子蟹、中华绒螯蟹、粗腿厚纹蟹也是DIV1的易感宿主[10-11]，但目前尚未有蟹类自然感染的报道。流行病学调查显示，该病毒在我国主要虾类养殖地区均有检出，如广东、福建、浙江、江苏、安徽、上海、山东、河北、天津等，流行分布非常广泛。因此给我国罗氏沼虾养殖生产的生物安保工作带来了巨大挑战。

甲壳动物对自身机体的免疫保护主要依靠血细胞来完成，血细胞随血液循环系统分布于全身各处，警戒着体外多种类型病原的入侵，如细菌、病毒、真菌、寄生虫等。血细胞会根据入侵病原类型和数量的不同，采取不同的免疫防御策略，如细胞吞噬、细胞结节、包囊等[12]。由于血细胞不能分裂，它们的更新补充须由血细胞的生产工厂——造血组织来实现。而DIV1首选靶组织是造血组织，当造血组织被病毒攻击后，机体免疫防御机能会被彻底破坏，易导致宿主快速死亡，因此DIV1的危害性非常大。

3.3 虹彩病毒的防控措施建议

罗氏沼虾“白点病”暴发的原因及其病原传播方式尚不清楚，能否垂直传播尚无证据。但根据本单位近几年的病原监测数据，DIV1在苗期已有检出，因此养殖户在购买罗氏沼虾虾苗时，应严格筛选不携带DIV1的苗种进行养殖生产。目前，为增加经济收益，混养模式已成为我国多数养殖地区的主流模式。在疾病防控工作中需特别注意，当混养近缘性的甲壳动物，如南美白对虾、罗氏沼虾、青虾和克氏原螯虾等虾类时，因这些品种均为DIV1的易感宿主，在引进苗种前同样需加强对DIV1的检测，以降低病原传入的风险。此外，罗氏沼虾与南美白对虾混养时，经常发现南美白对虾早于罗氏沼虾“偷死”。因此，当南美白对虾出现病症时，应及早检测、确诊，以便及时采取相应的措施，减少损失。

水温与虹彩病毒病的暴发存在一定的相关性。孙世玉等[13]发现，当水温保持在30 ℃以上，即使对虾携带有虹彩病毒也可正常生长，但转入低温环境则会引发疾病。本案例中，罗氏沼虾“白点病”的发病季节是秋季，水温17～20 ℃，处于高温转低温的阶段，与上述结论基本相符。因此，养殖生产中需注意水温的变化，尤其是携带病毒且尚未发病的池塘，可采取加温保温的措施，以防止水温降低而导致疾病暴发。

罗氏沼虾“白点病”发病速度快，传染性高，死亡率高，发病后很难挽救，因此重点在于预防。对有发病史的池塘应严格消毒清塘，防止二次感染。养殖过程中应及时了解周围其他养殖户是否有发病情况，尽可能避免因引进外塘水源或其他交叉感染因素而导致疾病传播。还可采取常用的预防病毒病措施——鱼虾生态混养，用凶猛性鱼类减少或消灭弱虾、病虾。此外，采取加强池塘底部增氧、泼洒益生菌等措施，可以避免条件致病菌大量生长繁殖，调控水质，减少发病概率。在降温期可通过增加水深、加强大棚保温、采取人工加温等措施来降低环境突变的影响。一旦发现感染DIV1，应及时做好发病池塘的管理，防止塘间传播，养殖废水不可任意排放，避免扩大传播区域。发病期间不宜使用刺激性大的消毒剂或纤毛虫类杀虫剂进行消杀，减少养殖虾的应激死亡。