一、称样

  （1）一般称量25g，由于称样量较大，标准中对于称样的准确性未作出明确规定，微生物室常用称样的电子天平最大允许误差为±0.1g，一般遵循“宜多不宜少”的原则，即实际称样时可根据样品情况称取超出25g（如硬质糖果等，检验人员应依据样品实际情况决定如何称样）；

  （2）对于部分食品添加剂已明确须称取1.0g的，则须严格精确称量。

二、样品稀释

  （1）固体或半固体：称取25g样品于均质袋中，加入已灭菌的生理盐水225g，稍捏碎（特别是糕点/面包及其他淀粉制品），放入拍击式均质器均质1min，此时即制备成1：10的样品匀液。以移液器或灭菌吸取该液体至9mL灭菌生理盐水试管中，换上新的灭菌移液器枪头，缓缓吸取液体后反复吹打2次，此时即制备成1：100的匀液，以此类推，制备10倍系列稀释匀液。

  （2）液体样品：直接吸取原液进行检验，稀释时可直接吸取1mL原液到9mL灭菌生理盐水试管中按照“固体或半固体”的方式稀释。

三、稀释度的选取

  液体样品可直接取原液进行检验；固体或半固体则必须依据检验经验，选取2-3个适宜稀释度进行检验（一般样品选取1：10，1：100，1：1000三个稀释度进行检验。若遇到不常做的样品，可适当延长稀释度至1：100000甚至1：1000000）。

四、质量控制

  空白对照：分别吸取1mL灭菌生理盐水到平皿中做空白对照。（若空白有菌落生长则该实验无效）。

五、平板计数琼脂（PCA）

  灭菌条件为121℃、15min。一般情况下于500mL敞口锥形瓶（三角瓶）中配制400mL/瓶。

六、

  有时样品基质比较特殊，样品匀液有细小的颗粒与菌落不易区分，此时可采用如下方法进行区分：

 （1）配制1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液（又称红四唑或红四氮唑，简称TTC），高压灭菌后避光冷藏备用。红四唑灭菌条件为：121℃、20min；

 （2）待PCA琼脂培养基冷却至适宜倾注温度时，无菌加入上述TTC溶液2mL，充分摇匀（此时PCA中TTC浓度为0.005%）。

  加入TTC的目的及注意事项：培养后，菌落被TTC染成红色，而样品颗粒不变色，方便计数；PCA中TTC的浓度不宜过高，否则会抑制微生物的生长，对实验结果产生影响。（特殊情况下方添加TTC，常规实验无须添加，特别是对于菌落数量较少的样品不宜添加。方法来源依据为《化妆品卫生规范》中菌落总数测定相关章节）

七、稀释液

  常采用0.85%氯化钠溶液（生理盐水），121℃、15min高压灭菌后冷却备用。

八、

  倾注培养基时，根据对样品污染情况的估计（同一类型样品的微生物检测经验），若样品有表面蔓延生长的可能性，则待第一次倾注的琼脂凝固后，可在表面再覆盖一层琼脂以避免菌落蔓延而难以计数。

九、

  水产品30±1℃培养72±3h；其它样品36±1℃培养48±2h。注意：此处的“水产品”是指生鱼片、鱿鱼干等未经深度加工的水产品。

十、

  本标准的重难点为菌落计数及计算。除标准中已说明的要求外，有以下几点需要注意：

 （1）菌落计数时，从低稀释度的平板开始计数。若所有平板上的菌落数均小于30CFU，则须计数所有平板上的菌落数，但仅采用最接近30CFU的两个平板的菌落数来计算最终菌落总数。

  以固体样品举例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：

 （2）当第一稀释梯度一个板上菌落数高于30，另一个低于30，则依据标准应当以介于30-300之间的菌落数作为该稀释梯度的菌落数。（存在争议，实际遇到该类情况时应谨慎对待）

  以固体样品举例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：

 （3）若所有平板上的菌落数均大于30CFU，则只计数30-300CFU之间的平板上的菌落数，并采用这些数据，依据标准中给定的公式，进行最终菌落总数的计算，此时将大于300CFU的记为“多不可计”，以“TNTC”表示。

  以固体样品举例，根据标准中给定的公示，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：

 （4）若所有稀释度的平板菌落数都大于300，则不能所有都计为TNTC，必须将最高稀释度的两个平板上的菌落逐一地计数，再计算平均数，该平均数为该梯度的菌落总数，其余平板上的菌落数可记为TNTC。

  以固体样品举例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：

 （5）计算菌落总数时，须严格按照标准要求进行计算。

  特殊情况：

  ①若所有平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数。“最低稀释倍数”并不是固定不变的，与检验人员选取的稀释度有关。如：某样品多次检验后发现菌落总数较高，检验人员在梯度稀释后取1:1000、1:10000、1:100000三个梯度的稀释液倾注平板，最终所有平板上的均无菌落生长，则计算过程为＜1×1000，最终结果为＜1000CFU；若选取1:10、1:100、1:1000三个梯度的稀释液倾注平板，均无菌落生长，则最终结果为＜10CFU。因此，稀释度的选择对于结果存在较大影响，选择时应谨慎。

  ②最低稀释度两个平板只有一个平板上长了1个菌落，若为固体样品且本次检验的最低稀释倍数为1:10，此时计算过程为（1+0）/2×10=5，由于默认固体样品最小检出量为10CFU，故本次检验的菌落总数结果为10CFU。注意：对于该情况一直存在争议，不同的检验人员可能做法不一，有人保留为5CFU，有人保留为10CFU，并无固定做法。（建议检验人员保持一贯做法，不要随意更改）

  举例如下：

十一、

  对于水产品、冷冻食品、速冻食品等菌落总数含量较高、限量值较大的食品类别，建议多增加稀释梯度（可稀释至10-4甚至10-5），避免稀释度较低、浓度较大导致培养后平板上菌落蔓延、弥散而难以计数甚至无法计数。