快速鉴定四大家鱼早期资源种类的PCR方法

季晓芬1,2，汪登强2，段辛斌2，刘绍平2，陈大庆2

(1.华中农业大学水产学院，武汉430070；2.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉430223)

根据线粒体控制区序列设计了青鱼(Mylopharyngodonpiceus)、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)物种特异的PCR引物，通过对四大家鱼受精卵的PCR扩增，种间交叉扩增，相关种类早期资源的扩增以及未知种类鱼卵的鉴定发现，所设计的引物具有很高的种类特异性，对特定种DNA具有良好的扩增效果，但是不能进行交叉扩增，对四大家鱼外的其它种类也不能扩增。实验没有出现一例假阳性或假阴性结果，说明所设计引物的种类特异性高。该方法特别适合从鱼类早期资源大量样本中准确快速鉴定四大家鱼种类。

四大家鱼；种类特异引物；PCR；分子鉴定

青鱼(Mylopharyngodonpiceus)、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙 (Aristichthysnobilis)是中国传统淡水养殖的“四大家鱼”，具有重要的经济地位。然而，近三十年来，由于过度捕捞、水体污染、涉水工程建设等原因，四大家鱼自然资源量呈明显下降趋势。在2010—2011年渔业资源调查发现，长江中游四大家鱼在渔获物中已不占优势[1]。对早期资源监测也发现，长江中游四大家鱼早期资源量也显著下降[2]。早期资源监测，特别是四大家鱼早期资源监测是当前开展渔业资源管理的基础性工作，并为各种保护措施的效果评估提供科学依据，具有重要的意义。

在鱼类繁殖季节，江河中有多种鱼类同时进行繁衍生息，要正确评估四大家鱼早期资源的变化，需要从鱼类早期资源中准确判断四大家鱼种类。以往对四大家鱼早期资源的鉴定主要依靠鱼卵卵径和颜色，或者鱼苗体型和花纹(易伯鲁等，1988)[3]，但是，颜色和花纹并非一成不变，种类间也存在重叠特征，要准确确定不仅需要一定的实践经验，同时也不容易区分。近年来也发展了一些分子生物学鉴定方法，如随机扩增多态性DNA(RAPD)[4]、限制性内切酶片段长度多态性DNA(RFLP)[5]、DNA条形码[6]、微卫星标记[7]以及PCR[8]等。这些方法提供准确的种类鉴定技术，但要从大量早期资源样本开展鉴定，十分费事费力，费用也很大。本研究在分析群体数据的基础上，根据四大家鱼线粒体DNA控制区的特异性，分别设计一对物种特异的引物，利用PCR技术特异扩增出四大家鱼的DNA片段，从而能够快速准确鉴定出四大家鱼种类，为四大家鱼早期资源监测及种类鉴定提供一种便捷方法。

1　材料与方法

1.1引物设计

根据PCR的原理，我们比较了四大家鱼之间及其与其他相关鱼类线粒体DNA控制区序列，遵循种类序列保守、种间差异大的原则，分别设计四大家鱼种类特异的引物如下(见表1)。这些引物除了鲢和鳙共用一条反向引物HymDR、位于线粒体DNA tRNA-Phe基因外，其余引物均位于控制区。引物在线粒体DNA的位置参考青鱼线粒体DNA(GenBank登录号：EU979305)。

此外，鱼类线粒体DNA cytb基因通用引物[9]用于扩增鱼卵DNA及测序，进行种类鉴定。

表1　四大家鱼PCR特异引物信息Tab.1　PCR Specific primers of the four carps

1.2实验设计及样本采集

为了验证方法的可靠性，本研究通过下列4个实验进行：(1)引物在四大家鱼种内扩增效率。将4对引物分别扩增相应的鱼的样本。每种样本收集30粒受精卵，采集4种鱼类受精卵各30粒，在2013年5月份四大家鱼繁殖季节采集于长江水产研究所荆州市窑湾繁殖场人工繁殖鱼卵，受精后24 h取样。(2)引物在四大家鱼种间交叉扩增特异性。将上述4对种特异引物分别扩增其它3种四大家鱼的受精卵样本，样本来源与前面相同。(3)引物对长江常见鱼类的早期资源扩增特异性。共采用27种鱼类(表2)，所有样本均为受精卵或鱼苗，2013—2015年5—7月份取自长江湖北监利江段和重庆江段。所有样本均预先用cytb基因通用引物L14724 和H15915扩增并测序，在GenBank数据库比对，以99%以上序列相似性为准，确定其种类，每一种各取5个。(4)对未知种类受精卵的种类的鉴定。2014年5—7月份本课题组在长江湖北省宜都江段开展早期资源监测，从收集的受精鱼卵随机挑选30粒。以上样本均在现场作好记录后，用无水乙醇保存，带回实验室备用。所有的PCR均设阳性对照，即采用引物特异的种类作模板。

1.3基因组DNA提取及 PCR扩增

基因组DNA采用试剂盒Easy-DNA kit(Omega公司，美国)提取。PCR扩增体系为25 μL，含10×PCR buffer(含Mg2+)2.5 μL、Taq DNA聚合酶1.5 U、10 mol/L dNTP 0.5 μL、引物10 pmol/L各1 μL、DNA模板1 μL。扩增条件为94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃再延伸8 min。cytb基因扩增体系前面相同，扩增条件采用56 ℃退火温度。

表2　四大家鱼及相关鱼类Tab.2　Four major Chinese carps and related fishes

1.4电泳检测

采用1×TAE缓冲液(0.04 mol/L Tris-乙酸，2 mmol/L EDTA,pH8.5)配制1%琼脂糖凝胶，凝胶中加入终浓度约为0.5 μg/mL的溴化乙锭(EB)。取3μL PCR产物与1μL Loading Buffer混合，加入点样孔， 10 v/cm电泳20 min。电泳结束后，在凝胶成像系统中观察，照相。

1.5DNA测序与种类鉴定

鱼卵cytb基因PCR扩增后，琼脂糖凝胶纯化回收目的片段，采用与PCR相同的引物进行双向测序。与GenBank数据上参考序列(序列号见表2)相似度在99%以上的，即确定为该种类。

2　结果

2.1引物在四大家鱼受精卵中扩增效果

本研究设计的4组种类特异的PCR引物分别扩增相应的四大家鱼受精卵结果见图1。从图1可见，4组引物分别对四大家鱼30粒受精卵均能扩增出单一、明显的DNA片段，其中草鱼扩增片段大小约为900 bp，青鱼约为750 bp，鲢约为950 bp，鳙约为600 bp，与引物设计长度一致。这表明，本研究所设计的引物针对四大家鱼具有良好的PCR扩增效果。

4组种特异引物对四大家鱼其它3种鱼受精卵

图1　四大家鱼PCR扩增结果Fig.1　Results of PCR amplication of four major Chinese carps

a.草鱼，b.青鱼，c.鲢，d.鳙，e.青(1-5)、草(6-10)、鲢(11-15)、鳙(16-20)，DNA分子量标准大小从上往下依次为2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp

的PCR结果显示，青鱼特异引物均不能扩增出草鱼、鲢、鳙的DNA(图2)，其它引物的扩增结果也类似。说明，这4组种特异引物不能进行交叉扩增，具有较高的种特异性。图2示青鱼特异引物对其它3种四大家鱼的PCR扩增结果。

2.2引物对长江常见27种鱼的PCR结果

4组引物对长江常见的27种鱼受精卵或鱼苗的PCR扩增结果见图3。从图3中可见，4组引物除了在特定鱼中能扩增出特异DNA带，而在其它鱼类中没有明显的扩增条带。例如，引物(I)在青鱼中能扩增出一条约750 bp的目的DNA带外，其它26种鱼中均没有DNA条带(图3a)。引物(II～IV)的扩增结果也相似。

图2　引物组I扩增四大家鱼结果Fig.2　Amplification result of the four carps using primer I 从左到右为青(1-5)、草(6-10)、鲢(11-15)、鳙(16-19)

图3　4种引物与27种鱼的PCR结果Fig.3　PCR results of four primers for 27 kinds of fishes

a为引物I，b为引物II，c为引物III，d为引物IV，图中M为DNA分子量标准。

2.3对未知种类鱼卵的鉴定

图4　未知种类鱼卵的PCR结果Fig.4　PCR results of unknown species of fish eggs a为引物组II，b为引物组III

3　讨论

本研究根据线粒体DNA控制区序列的种类差异性，设计了4对四大家鱼种类特异的引物，通过对较大样本的特定种类PCR扩增以及种间交叉扩增，结果显示，这些引物对特定种具有良好的扩增效果，对交叉种类则完全没有扩增，实验没有出现一例假阳性或假阴性结果，说明所设计引物的种类特异性高。由于四大家鱼以及相近种类在系统进化中地位很近，即使是变异率较大的线粒体DNA控制区序列在这些种类间相似性也很高，我们在设计引物时，为了提高种类特异性，选择了差异较大的区域，并保证引物组中一条或两条引物的3′与特定种完全一致，与其它种尽可能有差异，同时通过提高PCR退火温度来降低引物错配率。从实验结果看，达到预期的目的。

实验中我们也发现，PCR技术是一项十分灵敏的技术，对早期资源鉴定，一定要避免DNA样本交叉污染，否则容易出现假阳性。在野外工作中，收集的早期资源量比较大，各种类卵苗经常同时出现，保存时也常保存在一个样本瓶中。因此，在提取DNA时一定要将样本外表清洗干净，由于样本小，可以将样本分开后用蒸馏水浸泡过夜，期间换水几次，减少样本表面附着的外源DNA。本研究中也发现疑似外源DNA污染的情况，如图3d，25号样本，尽管经DNA测序确定汉水薄鳅，但电泳中出现很弱的、与鳙目的DNA大小相同的条带。这也可能是样本序列变异造成的，但是DNA条带亮度差异很大，总体上并不影响结果的判定。

本研究建立的方法很适合应用于从早期资源监测收集的大量样本中快速鉴定出四大家鱼种类，也可用于外部形态不完整的组织块等鉴定。由于长江等河流还有很多种鱼类，今后还需采集更多种类的鱼进一步验证引物的特异性。此外，这4组引物扩增得片段大小有差异，所以通过优化PCR条件，开展多重PCR，可以更快更好的完成种类鉴定。

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