乳酸菌在水产养殖中的研究进展

赵海洋，张蓉，孙浩伟，包帅，田祚宁，曹永春

（1.北京农学院动物科学技术学院，北京 100096；2.北京市农林科学院水产科学研究所，北京 100068；3.昌邑市畜牧业发展中心，山东 潍坊 261300）

根据《2023 年中国渔业统计年鉴》报道，我国2022 年水产养殖产量为6 690.29 万t，同比增长2.16%，养殖方式从粗放式走向精细化。但随着单位水域养殖密度的增加，养殖水域的环境恶化，给病原微生物的传播创造了有利的条件。在水产养殖中，健康管理和病害防治是关键，益生菌制剂的应用，已成为水产病害防治的重要技术手段之一。目前水产养殖中应用的一些传统益生菌，并非鱼类消化道原籍优势菌群，在鱼类应用时，可能存在弊端和风险。而分离于动物肠道或养殖水体的微生物，制备成的微生态制剂，即原籍菌群[1]，可以避免排斥现象产生，在最大程度发挥益生功能的同时，保障肠道的微生态平衡，将受到的外来干扰降到最低，防止产生异常增殖[2]。

乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）作为肠道的“原籍菌”，是一类以碳水化合物为底物，经发酵产生乳酸的细菌的总称，广泛分布在人及动物的肠道、食品及环境中。乳酸菌属于革兰阳性菌，非孢子化，厌氧或兼性需氧，球或杆状[3]，最佳生长pH 值一般在5.5～5.8，营养需求复杂，分为同发酵和杂发酵，同发酵从糖中产生乳酸，而杂发酵产生乳酸、乙酸、酒精和二氧化碳[4-5]。乳酸菌进入肠道后，可迅速定植于肠道，形成优势菌群，代谢产生益生物质，增强鱼类免疫调节功能，改善鱼类肠道结构，促进鱼类新陈代谢与生长，因而受到人们的广泛关注[6]。现简述乳酸菌作为饲料添加剂的抗氧化作用机制及其在水生动物养殖中的应用现状，以期为乳酸菌制剂在高密度水产养殖业中的进一步应用，提供理论依据。

1 乳酸菌分类

1.1 乳杆菌属

乳杆菌属为长杆状或球状，通常成短链。革兰阳性，不生孢，兼性厌氧，有时微好氧，在有氧时生长差，降低氧压时生长较好。存在广泛，嗜酸性，最适pH 值为5.5～6.0，pH 值在3.0～4.5 时仍能生存，在乳杆菌中，植物乳杆菌是被研究最多的菌株。Piccolo等[7]评估了植物乳杆菌对欧洲海鲈的生长性能和血清生化参数的影响，补充植物乳杆菌喂养90 d，对生长性能有明显的影响，血清生化参数中的总胆固醇和甘油三酯也有明显增加。Soltani 等[8]在80 d 的喂养试验中，研究了3 种不同剂量的植物乳杆菌，对鲤生长和血液免疫学参数的影响，结果显示，植物乳杆菌使鲤的生长性能和血液免疫指标有正增长，具有明显较高的溶菌酶和碱性磷酸酶，还可以提高鲤对嗜水气单胞菌引起的动静脉败血症的抗病能力。Kane 等[9]评估了植物乳杆菌，对用链球菌和乳酸菌疫苗处理的虹鳟的血清生化以及免疫反应的影响，结果显示，给免疫后的鱼喂食植物乳杆菌，引起免疫参数如溶菌酶、替代补体活性、白细胞和淋巴细胞总数以及血清生化参数等明显增加。

1.2 片球菌属

片球菌属革兰染色为阳性，球状，直径1.2～2.0 μm，菌体排列成四联状，也可成对排列，单个细胞罕见，不形成链状，不运动，不产芽孢。兼性厌氧，有的菌株在有氧时会抑制生长。在过去的十几年中，人们关注水产养殖中使用的片球菌属益生菌，大多数研究都集中在乳酸片球菌方面。饲料中添加乳酸片球菌，对斑马鱼精子质量有影响，用益生菌处理斑雄性马鱼10 d 后，发现与雄性和精子质量有关的选定基因有明显的上调[10]。Hoseinifar 等[11]研究了虹鳟中单一或联合添加乳酸片球菌和低聚半乳糖的效果。虽然单一给药，对其生长性能没有明显影响，但联合给药，明显改善了生长性能参数。此外，也观察到，补充乳酸片球菌，可以明显提高免疫反应和对链球菌的抵抗力，在对鲤的研究中，也观察到类似的结果[12]。

1.3 肠球菌属

肠球菌属呈球形或卵圆形，在液体培养基中为成对或短链，不生芽孢，为革兰阳性菌，有时以鞭毛运动，没有明显的荚膜，兼性厌氧。通常生长温度在10～45 ℃，在pH 值9.6、6.5%氯化钠（NaCl）中和40%胆盐中也能生长。肠球菌属中的粪肠球菌，是水产养殖中研究最多的益生菌之一，从2014 年开始有一些报道。Allameh 等[13]研究了口服粪肠球菌，对爪哇鲤生理反应的可能影响。爪哇鲤以单剂量喂养5 周，在饲养期结束时，益生菌组的消化酶活性以及肠道短链脂肪酸（丙酸和丁酸）都有明显增加。Matsuura 等[14]也报道了口服粪肠球菌后，细胞介导的免疫反应的提升。

1.4 乳球菌属

乳球菌属是Schleifer 等[15]在1985 年提议设立一个新的菌属，这个菌属的大多数细菌原来是链球菌属和乳杆菌属中的细菌。乳球菌属革兰染色为阳性，球状、卵圆状，直径0.5～1.5 μm，菌体排列成对和短链。Nguye 等[16]从野生海洋鱼类的肠道中分离出乳球菌WFLU12，研究发现，WFLU12 通过竞争性排斥和增加先天性免疫反应，保护鱼类免受副猪链球菌感染。此外，用益生菌喂养的鱼的生长性能和饲料利用率都有所提高，这些结果突显了分离宿主相关益生菌的重要性，是一个值得进一步研究的课题。孔雨昕等[17]在乌鳢饲料中添加乳酸乳球菌，饲喂8 周后，观察各试验组肠道形态，发现处理组乌鳢肠道中部的皱襞高度高于对照组，并且显著提高了cld3 的相对表达水平，维护了肠道物理屏障。

2 乳酸菌抗氧化机制

氧化应激，指细胞内氧自由基水平升高，导致脂质、蛋白质和DNA 损伤[18]。活性氧（ROS），包括超氧阴离子自由基、羟基自由基和过氧化氢，是高活性氧自由基之一。在进化过程中，大多数生物体，具有酶防御、非酶抗氧化防御以及修复系统，以保护其免受氧化应激[19]。然而，这些天然抗氧化系统，通常不足以防止生物体受到氧化损伤。添加能够延迟或防止细胞基质氧化物质，可保护机体免受氧化损伤。因此，近年来从生物资源中寻找更安全、天然的抗氧化剂，来替代合成抗氧化剂，引起了极大关注。乳酸菌在宿主肠道中表现出显著的抗氧化活性，并促进抗氧化酶的产生，以帮助去除宿主肠道中的ROS，从而减轻氧化损伤。乳酸菌的抗氧化特性已在体外和体内得到证实，但是抗氧化活性的机制尚不完全清楚。目前的研究认为，乳酸菌可能通过清除ROS、螯合金属、增加抗氧化酶水平和调节微生物群，来发挥抗氧化作用。

2.1 清除自由基

ROS 和活性氮，主要是在暴露于干扰细菌或宿主细胞代谢的压力条件下产生的。大多数LAB具有清除O2自由基的系统，通过这些系统，可以降低食品发酵过程中自由基积累的风险和这些自由基对宿主生物体的损害。许多益生菌菌株及其代谢产物，在体外表现出对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、氧离子（O2-）和过氧化氢（H2O2）的高清除能力，这些清除活性，通常随着细菌细胞浓度的增加而增加[20]。有研究表明，某些菌株的培养上清液，表现出明显高于完整细胞的自由基清除活性[21]，而在另一项研究中，完整细胞的清除活性又高于上清液[22]。这可能是由于益生菌品种之间的差异造成的。

2.2 金属离子螯合

据报道，螯合剂如乙二胺四乙酸（EDTA）、巴菲咯啉二磺酸（BPS）、青霉胺和去铁胺，可以捕获金属离子，防止金属离子催化氧化[23]。Lin 等[24]在1999 年测定了19 种LAB 菌株的金属离子（亚铁离子和铜离子）螯合能力，结果显示，嗜热链球菌821 对Fe2+（亚铁离子）和Cu2+（铜离子）都表现出最好的螯合能力。其他菌株也显示了对Fe2+或Cu2+的螯合能力。此外，干酪乳杆菌KCTC 3260，通过螯合Fe2+和Cu2+，被证明具有很高的抗氧化能力[25]。尽管益生菌中金属离子螯合作用的机制还不是很清楚，但研究表明，过渡金属离子可以抑制酶催化的磷酸酯置换反应，并通过氢过氧化物的分解，产生过氧自由基和烷氧自由基[26]。因此这些益生菌菌株的螯合能力，可能是由于存在于益生菌细胞内无细胞提取物中的生理性螯合剂[24]。

2.3 酶的调节

LAB 有自己的抗氧化酶系统，大多数LAB 可以通过产生抗氧化酶来清除自由基，将自由基分解为O2和H2O2[27]。据报道，属于乳球菌和嗜热菌菌株的无细胞提取物中，具有超氧化物歧化酶（SOD）活性，其中乳球菌的活性高于嗜热菌[28]。此外，表达高水平SOD 或过氧化氢酶的LAB 菌株，可以作为传统食品应用和新的治疗用途的一种策略来开发。LAB 可以诱导宿主抗氧化酶的活性，从而调节抗氧化系统，减轻氧化压力。补充乳酸菌后，不仅在血清中观察到SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽（GSH）过氧化物酶等活性的增加，而且在各种动物的不同组织（肝脏）中也被观察到，表明乳酸菌具有强大的抗氧化特性[29]。

2.4 肠道微生物群的调节

在肠道病原体过度增殖的情况下，肠道上皮细胞会产生并释放大量的ROS，造成严重的氧化应激。已经证明，肠道微生物群，可以调节氧化还原信号，影响宿主的氧化还原平衡[30]。补充LAB，可以调节肠道微生物群，据推测，LAB 可能部分地通过重建宿主的肠道微生物群，组成而发挥其抗氧化作用[31]。乳酸菌对肠道微生物群的调节与氧化应激密切相关，在高脂肪饲粮喂养的小鼠中，用硫辛酸处理后，ROS 和MDA 减少，总抗氧化能力增加，这与乳酸菌呈强烈的正相关，与大肠杆菌和肠球菌呈负相关[32]。补充约翰氏乳杆菌BS15，减轻了高脂肪饲料引起的氧化应激，并改变了小鼠肠道中厚壁菌和拟杆菌的比例，表明LAB 对肠道微生物群的调节，有可能改善宿主的氧化还原状态[33]。

3 在水产中的应用

在水产养殖中，乳酸菌主要作为益生菌来改善水产动物健康和其生产能力。

来自土壤和大气的铅，污染了水体，对水生动物产生不利影响。Giri 等[34]研究了罗伊氏乳杆菌P16对鲤接触铅引起的毒性的保护作用，表明罗伊氏乳杆菌P16 减少了铅暴露引起的氧化应激，扭转了肠道微生物群的有害变化，恢复了肠道酶的活性。在针对耶尔森病的疫苗中加入植物乳杆菌426951，可显著提高溶菌酶和碱性磷酸酶的活性，并增强虹鳟的疫苗接种效果[35]。LAB 可以产生具有抗菌活性的物质，如细菌素、抗真菌肽等[36]。其中，细菌素、核糖体合成的细胞外肽或蛋白质分子，对不同类型的微生物具有杀灭或抑制作用，占据特殊地位。最初，不同菌株产生的细菌素，被认为只对其他密切相关的LAB 物种有活性，但进一步的研究表明，它们对系统发育较远的革兰阳性菌和革兰阴性菌，也有抗菌活性。LAB 抗菌化合物的抑制谱，包括引起鱼类和贝类疾病的微生物，如沙门氏气单胞菌、嗜水菌、沙门氏弧菌、致病性大肠杆菌等[37-38]。副溶血性弧菌是引起急性肝胰腺坏死（AHPND）的病原体，当虾感染溶血性弧菌时，饲料中加入嗜酸菌和酿酒酵母作为益生菌混合物，可以减少肝胰腺病变，保护虾免受AHPND 发病的影响[39]。

大量的体外和体内研究显示，LAB 对呼吸道和胃肠道病毒如轮状病毒、诺瓦克病毒等，具有潜在的抗病毒活性[40]。Harikrishnan 等[41]的研究表明，使用乳酸菌，产生了对褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）的淋巴细胞病病毒（LCDV）的抗性。Son等[42]研究证实，添加植物乳杆菌的饲料，增强了石斑鱼（Epinephelus coioides）对虹膜病毒的先天免疫反应和抵抗力[42]。Nakayama 等[43]将LAB 的抗病毒活性机制，归结为与病毒的直接接触，通过诱导抗病毒基因的表达，来抑制病毒的复制调节，或刺激宿主免疫系统功能。Jung 等[44]研究表明，给予高剂量的乳酸杆菌，能促进快速诱导抗体IgG1、IgG2a、先天免疫细胞和细胞因子。乳酸菌支持体液免疫和细胞免疫，刺激溶菌酶的释放，激活吞噬作用，从而提高身体对感染的整体保护水平[45]。越来越多的试验表明，通过预防性使用乳酸菌，可以改善养殖水生动物的健康状况和养殖水体的质量，提高生产性能。

4 结语

乳酸菌能调节肠道微生物平衡，促进鱼类的生长和发育，增强鱼类的免疫力和抵抗力，是一种安全的微生物添加剂，广泛应用于饲料工业。随着我国绿色水产养殖业的发展，乳酸菌在水产养殖中发挥了重要作用，对乳酸菌的有效性、特异性和多样性提出了更高的要求。筛选特异性功能菌株，利用现代生物技术，不断增强乳酸菌产品的功能，有针对性地使用乳酸菌产品，建立可持续、稳定、安全的水产养殖微生态系统，将是水产养殖研究领域开展乳酸菌研究和应用的重点任务。